菌渣好氧堆肥过程中腐熟度指标及红外光谱的动态变化

王艮梅 ，黄松杉 ，王良桂 ，郑光耀

1. 南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037；2. 南京林业大学林学院，江苏 南京 210037；3. 中国林业科学院林产化工研究所，江苏 南京 210042

中国食用菌产业发展迅速。根据《中国食用菌年鉴》的统计，2000年中国食用菌产量只有664万吨，到2012年产量已增至2828万吨，而目前已突破3100万吨（中国财经网，2015），占全球总产量的70%以上，排名世界第一（苏安祥，2013）。由此也导致了菌渣废弃物产生量急骤增加。而中国高度集约化养殖业每年产生的畜禽粪便（鲜重）高达40亿吨（阎波杰等，2010），其中鸡粪在畜禽粪便中占有较大比例（武晋萍等，2019），如何合理处置这些固体废弃物成为亟需解决的重要社会和环境问题（王莹等，2013）。

菌渣中的有机质丰富、养分含量高、容重小、孔隙度大，是极具资源化利用潜力的一种固体废弃物。而传统的菌渣处理方式多为丢弃或焚烧，这不仅造成了农业有机资源的浪费，也对周围的环境造成污染。近些年来，菌渣资源化综合利用研究受到很多学者的关注（胡晓婧等，2014；孙杰等，2015；Jordan et al.，2008；Herrero-Hernández et al.，2011；Zhang et al.，2014；Lopes et al.，2015；Lou et al.，2015；Karas et al.，2016），涉及的资源化利用方式有：用作饲料、制作有机肥、生产生物农药、用作生态环境修复材料、代替原生材料栽培食用菌、制造沼气、用作园艺基质等。在众多的利用方式中，高温堆肥处理方式被各国研究者普遍认可（刘超，2018；王义祥，2019；Zhang et al.，2014），在有机质稳定化的同时，还可以降低物料中的有毒有害物质，如重金属活性、病原物、盐分等。为保证堆肥产品质量，对堆肥的腐熟度进行评价不可或缺。但由于堆肥原料的多样性，以及堆肥过程中形成的中间产物的复杂性，堆肥腐熟评价指标和参数尚无统一的标准，因此，对堆肥腐熟度的评价一直是堆肥技术研究中的难点之一。

在已有的大量研究中，通常用物理、化学和生物学参数指示堆肥的腐熟程度（Levanon et al.，2002；Bernal et al.，2009）。单一指标参数难以准确确定堆肥的化学及生物学的稳定性，实际研究中，研究者通常选择多个指标来评价堆肥的腐熟度，目前高温发酵堆肥技术评价涉及温度、水分、C/N、pH、种子发芽指数、养分元素等的研究较多，而在堆肥腐熟过程中对有机物质的结构及成分变化的研究相对较少。现代的傅里叶红外光谱分析技术能很好地分析有机质的结构变化特征，可作为堆肥腐熟稳定程度评价的理论依据（宋彩红等，2015）。本研究以食用菌菌渣为主要堆肥材料（主要成分为杨树木屑、甘蔗渣、玉米芯），豆渣和鸡粪为添加材料，在采用常规腐熟度评价指标的基础上，结合红外光谱分析，研究堆肥过程中菌渣堆肥理化参数的变化及有机物质结构的动态变化特征，为深入探讨菌渣堆肥过程中有机物转化的内在机理，实现菌渣堆肥的资源化利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌渣由绿雅（江苏）食用菌有限公司提供，为杏鲍菇栽培废料，其成分主要是杨树细木屑、甘蔗渣和玉米芯，使用前打碎晒干，供试黄豆渣、鸡粪购自市场。供试菌剂购自宜春强微生物科技有限公司。补充氮素的来源为尿素（分析纯）。供试材料的基本性质见表1。

1.2 试验处理设计及实施过程

菌渣堆肥腐熟试验共设计3个处理，分别为菌渣与黄豆渣混堆（C1），菌渣与鸡粪混堆（C2）和菌渣直接堆制（C3），其中菌渣与豆渣、菌渣与鸡粪两种处理的物料在适宜的碳氮比下，按照相同的质量比进行配比，3种处理物料的具体用量为：菌渣42.71 kg+豆渣22.78 kg；菌渣36.32 kg+鸡粪19.37 kg；菌渣61.53 kg。

试验设在东南大学九龙湖校区的试验场露天空地，采用静态好氧堆肥技术进行堆制。具体堆制过程如下：将新鲜的菌渣去袋、打碎、晒干，将菌渣与豆渣和鸡粪按照事先设定好的比例混匀，同时每个堆体添加适量的微生物菌剂（20 g）和尿素（100 g），同时调节堆体的水分至60%左右，堆制成近1 m高的圆锥形堆体。为保证氧气供应充足，分别在堆肥开始后的第10、20、30天进行翻堆。每日09：00及17：00用探针式数显温度计，插入堆体中部（约40 cm深）进行读数，随机选取3点测量温度，取平均值作为实测温度，同时用水银温度计记录当天的环境温度。堆肥开始后第0、3、9、15、21、29、37、43天进行动态采样，每个堆体按照5点采样法采集两袋样品，一袋采回后立即放入4 ℃冰箱保鲜，用于测定种子发芽指数GI，另一袋采回后风干用于测定堆体pH、电导率、胡敏酸（HA）及富里酸（FA）含量、全C及全N含量，以及分析红外光谱特性。

1.3 样品的测定指标及方法

pH和电导率（EC）（GB 7859—1987）：称取风干样按固液比1꞉10，在室温下振荡1 h后测定。pH值使用pH计（pHS-3C）测定，EC使用电导率仪（DDS-310）测定。

碳氮比（C/N）测定（鲍士旦，2011）：总碳含量采用重铬酸钾外加热法；总氮含量采用半微量凯氏定氮法。

种子发芽指数（GI）（GB/T 23486—2009）：取5 g堆肥鲜样于150 mL三角瓶中，加入50 mL蒸馏水，30 ℃下振荡24 h后，过滤，吸取5 mL滤液，加到铺有滤纸的 9 cm培养皿内。每个培养皿点播30粒饱满的小白菜（Brassica campestrisL. ssp.chinensisMakino）种子，放置在(20±1) ℃培养箱中培养，24 h后测种子发芽指数（GI）。每个处理重复3次，以蒸馏水为对照。发芽指数GI的计算方法：

式中，GI为种子发芽指数；G为堆肥样品浸提液中种子的发芽率；L为堆肥样品浸提液中种子的根长；G0为蒸馏水中种子的发芽率；L0为蒸馏水中种子的根长。

FA、HA分离及含碳量测定：采用 GB7858—1987方法。称5.0 g堆肥风干样+100 mL浸提剂（0.1 mol·L-1Na2P2O7与 0.1 mol·L-1NaOH 等体积混合液）振荡5 min，放在沸水中煮1 h，摇匀，离心后收集清液待测。（1）HA+FA总碳量的测定：吸取5—15 mL待测液于放有少量石英砂的试管中，逐滴加入0.5 mol·L-1硫酸，中和到pH=7出现浑浊，将大试管放在水浴上蒸发至近干，然后按重铬酸钾外加热法测定总碳量。（2）HA总碳量的测定：吸取待测液20—50 mL于250 mL锥形瓶中加热近沸，逐滴加入0.5 mol·L-1硫酸，使溶液pH调至2—3有絮状胡敏酸沉淀产生，在水浴上 80 ℃保温半小时，静置过夜，使胡敏酸和富里酸充分分离。取细孔滤纸，用0.025 mol·L-1硫酸湿润，再将上清液倒入过滤，用0.05 mol·L-1硫酸洗涤沉淀多次，直到滤液无色，弃去滤液。将胡敏酸沉淀用热的 0.05 mol·L-1NaOH溶液洗涤溶解完全，过滤入100 mL容量瓶，直至滤液无色，定容摇匀。吸取定容液10—25 mL移入有石英砂的大试管中，用0.5 mol·L-1硫酸调至pH=7，使溶液出现浑浊，在水浴上蒸至近干，采用重铬酸钾外加热法测定胡敏酸碳量。

表1 试验材料基本性质Table 1 Basic properties of the tested materials

傅立叶红外光谱扫描（徐玉坤等，2014）：将堆肥样在60 ℃下烘干，粉碎过100目筛，在红外干燥灯下与KBr混合研磨，制作压片。采用傅立叶变换红外光谱仪（德国布鲁克VERTEX 80V）对压片进行红外光谱扫描，扫描光谱范围为400—4000 cm-1。

1.4 数据分析

运用Excel对测定结果进行分析及作图，OPUS软件进行扫描光谱图制作和分析。

2 结果与讨论

2.1 堆肥过程中温度的变化

图1 菌渣堆肥过程中温度动态变化Fig. 1 Changes of temperature during composting

堆肥过程中，3种处理的堆体温度变化明显。图1显示，堆肥过程中堆体共经历了3次温度升降阶段，且在整个堆制过程中堆体温度都明显高于环境温度，在堆制第38天时堆体的温度基本稳定。堆肥初期，温度上升迅速，堆肥第4天，堆体温度均达到高温（50 ℃以上），第8天堆体温度达到第一阶段峰值（C1：54.3 ℃，C2：52.3 ℃，C3：58.7 ℃），之后，温度开始有所下降。第10天翻堆后，堆体温度又逐渐回升，直至第24天，3种处理的堆体温度一直处于相对稳定的高温水平。第24天之后，堆体温度总体呈动态下降趋势，逐渐回落到一个相对稳定的低温水平，至此堆肥过程结束。尽管堆制过程中3种处理的堆体温度变化总体趋势一致，但仍存在一定的差异。从图中可以发现，C3处理的堆体的温度在整个堆肥过程略高于C1、C2处理，尤其在堆肥的前两个阶段，在堆肥后期，3个处理之间的温度变化无明显规律。根据堆肥腐熟的温度指标，堆肥过程中堆体温度在 50 ℃以上保持 10 d，或60 ℃以上保持5 d，即可推断，堆肥已达到腐熟条件（GB7959—2012）。堆肥初期，物料中易于降解的有机物及养分物质，如糖类、淀粉、蛋白质、脂肪等，在微生物作用下分解，并释放出二氧化碳和热量，堆体温度迅速上升，达到 50 ℃以上。随着过程进行，第一阶段后期，温度略有下降，主要由于随着分解过程进行，堆体的氧气供应量不足所导致。第10天堆体翻堆后，氧气得到了补充，堆肥进入第二次升温阶段，除了易分解有机物的继续分解外，在耐高温细菌作用下，大部分较难分解的半纤维素、纤维素、木质素等也开始被氧化分解，同时释放出热量。到了这一阶段的后期，堆体中能分解的有机物基本被分解完全，产生的热量逐渐减少，温度逐渐下降，后期温度到达 40 ℃左右，堆肥已经基本稳定。之后，堆肥进入第三阶段的熟化稳定期。一些微生物会借助残留有机物生长，此时堆体温度稍高于大气环境温度，并趋于稳定，有机物深度腐熟，堆肥过程结束。

2.2 堆肥过程中pH的变化

堆肥过程中不同时期 pH值的动态变化如图 2所示。随着堆肥时间的延长，堆体pH值总体都呈增加趋势，其中菌渣与豆渣堆肥（C1）从初始的7.80上升至8.60；菌渣与鸡粪堆肥（C2）从初始的7.71增加至8.34；菌渣堆肥（C3）从初始的7.76增加至8.41。随着堆肥过程的进行，含氮的有机物分解矿化产生 NH3，使堆体 pH值缓慢上升至微碱性（Zucconi et al.，1981；Cegarra et al.，2006），堆肥末期，菌渣堆肥pH值略有下降可能是由于温度下降后硝化细菌活性增强，硝化作用产生H+所致（周江明等，2015）。

图2 菌渣堆肥过程中pH的动态变化Fig. 2 Changes of pH value during mushroom dregs composting

一般认为，堆肥初期微生物分解有机质产生有机酸，会导致pH降低，随后温度升高，一部分有机酸挥发，同时产生NH4+-N及NH3，致使pH升高，到堆肥末期随着硝化作用的进行，NO3--N逐步积累，pH再次下降。本试验初期pH值并未出现下降可能与试验中加入了一定量的尿素，分解后转化为NH4+-N及NH3有关。堆肥的pH值在7.5—8.5之间，可以获得最大腐熟速率，过高会造成大量的NH3挥发，造成氮素损失（鲍艳宇等，2006）。堆肥最终产品的pH值也达到了通常认为的堆肥腐熟标准（pH 8.0—9.0）（李艳霞等，1999）。

2.3 堆肥过程中电导率（EC）的变化

电导率（EC）反映了堆肥过程中可溶性电解质的总量，在一定程度上与堆肥中的盐浓度呈正相关。如图3所示，试验中3个处理的堆体EC值总体变化不大，在1.0—2.5 mS·cm-1范围内浮动。在堆肥的各个时期C1处理和C2处理的EC值基本相近，且均高于C3处理，这是由于豆渣和鸡粪的初始电导率均高于菌渣。Soumaré et al.（2002）建议将3000 μS·cm-1作为堆肥产品的EC最大限值。一般认为，当微生物代谢旺盛时，因分解有机物产生小分子有机酸、磷酸盐、铵盐等会导致EC值的上升（Abid et al.，2006），随着二氧化碳、氨气的挥发，各种矿物盐离子的沉积，EC值会下降（李家祥，2012）。

图3 堆肥过程中电导率（EC）的动态变化Fig. 3 Changes of EC during mushroom dregs composting

2.4 堆肥过程中C/N的变化

在堆肥过程中，有机物料在微生物作用下分解转化，其中，部分碳源、氮源被微生物利用吸收，部分转化为CO2、NH3（NH4+）、亚硝酸盐和硝酸盐以及腐殖质等，因此堆肥过程中的C/N在一定程度上可以反映堆肥的腐熟程度（罗泉达等，2009）。堆肥的固相C/N值从初始的25—30降到15—20时，认为堆肥达到腐熟（柴晓利等，2005）。从图4可以看出，经过腐熟过程，各处理堆体的C/N总体都呈下降趋势，至堆肥末期均降到了20以下，达到了堆肥腐熟的要求。

图4 堆肥过程中C/N的动态变化Fig. 4 Dynamic changes of C/N during mushroom dregs composting

2.5 堆肥过程中GI的变化

种子发芽指数（GI）是通过测试堆肥浸提液的生物毒性来评价堆肥腐熟程度的指标。如果堆肥未腐熟，其中的一些成分会导致植物生长受到抑制，而在腐熟后其中的养分会促进植物生长。未腐熟堆肥的生物毒性，主要来源于堆肥中低分子量有机酸（如乙酸）和大量 NH3、多酚等物质（柴晓利等，2005）。如果GI大于50%，可认为基本腐熟；如果GI大于 80%，可认为堆肥已经完全腐熟（钱学玲等，2001；刘超等，2018）。图5所示为堆肥过程中3个处理的GI动态变化结果，在堆肥初始阶段，3种处理的堆肥对种子发芽存在明显的抑制作用，种子发芽指数分别为20.60%（C1）、22.45%（C2）和19.78%（C3），随着堆肥时间的延长，3种处理种子发芽指数都呈逐渐上升趋势，至 21 d时，都超过50%。之后种子发芽指数继续上升，至堆肥结束时，C1、C2分别为81.02%、83.36%，C3处理的种子发芽指数为72.46%。

图5 菌渣堆肥过程中发芽指数（GI）的动态变化Fig. 5 Dynamic changes of germination index (GI) during mushroom dregs composting

从图5可以看出，在整个堆肥过程中菌渣与鸡粪堆肥的 GI值比对应的菌渣与豆渣堆肥、纯菌渣堆肥的值大，说明菌渣与鸡粪堆肥的浸提液对植物的毒性最小，但至堆肥结束时，菌渣与豆渣及菌渣与鸡粪堆肥均已完全腐熟。于子旋等（2016）研究指出，种子的培养时间对 GI值有一定的影响，同样的牛粪、鸡粪及猪粪的堆肥44 d的浸提液培养种子24 h的GI值在70%左右，而培养48 h的则在90%。本试验的种子培养时间为24 h，GI值在43 d时都在70%以上。有资料表明，如果种子发芽指数低，不一定是因为腐熟度低，还可能受堆肥产生的有机酸及氮的缺乏和盐分含量影响（柴晓利等，2005）。因此，以GI作为堆肥腐熟度评判指标时，也应当综合其他指标加以辅证。

2.6 堆肥过程中腐殖酸含量的变化

堆肥中腐殖质成分复杂，其中胡敏酸（HA）是分子量大小不等的一系列高分子缩聚物，而富里酸（FA）是腐殖质中分子量较小、活性较大、氧化程度较高的组分（王玉军等，2009），它们的比值（HA/FA）称为腐殖化指数，在一定程度上可以反映堆肥的腐熟程度（崔玉波，2013）。堆肥过程实质上是有机物转化为腐殖质的过程，堆体内发生着矿质化作用和腐殖化作用。HA/FA可以有效地反映堆肥腐熟情况，其值的增大，表明堆肥中腐殖化作用程度的加深，堆体中形成了更多的高分子聚合物，这些大分子缩聚物是堆肥成品中腐殖质的有效成分。

从图6可以看出，除C2处理（菌渣+鸡粪）在堆肥前期略有下降外，堆肥过程中3种处理HA的含量均呈逐渐增加趋势，其中3种处理的HA质量分数从堆肥初始至堆肥结束时分别为 26.01、35.68 g·kg-1（C1），23.43、33.34 g·kg-1（C2），27.34、40.58 g·kg-1（C3）。FA 含量在整个堆肥过程中无明显变化，总腐殖酸含量随着堆肥的时间的推进呈逐渐升高趋势，这与张雪英等（2004）的研究结果相似，但与张盛华等（2014）的研究结果不一致，一般认为，堆肥过程中腐殖酸含量的差异与堆肥原料及堆肥条件关系密切。

图6 菌渣堆肥过程中腐殖酸含量的变化Fig. 6 Changes of humic acid (HA) and fulic acid (FA) content during mushroom dregs composting

图7 显示，HA/FA随着堆肥的进行，总体呈上升趋势，表明堆肥的腐殖化程度和腐熟度增加。本研究结果表明，堆肥过程中胡敏酸含量明显高于富里酸含量，这可能是由于堆肥过程中，腐殖质分解产生的低分子量富里酸一方面通过分子聚合产生大分子的胡敏酸，另一方面富里酸较胡敏酸易降解，使堆肥过程中HA/FA呈升高趋势。

图7 菌渣堆肥过程中胡敏酸与富里酸含量比值的变化Fig. 7 Changes of the ration of humic acid (HA) content to fulic acid(FA) content during mushroom dregs composting

2.7 堆肥过程中红外光谱分析

大量研究表明，红外光谱可应用于堆肥质量的快速评估（Francou et al.，2013；Yang et al.，2006；Albrecht et al.，2008；Fujiwara et al.，2007）。堆肥样品的FTIR谱图直观地反映出3种堆肥方式在堆肥前后物质结构的变化。3种处理堆肥过程中红外光谱图如图8所示，可以看出，3种处理的堆肥过程中均出现相似的吸收峰，说明3种处理堆肥含有的主要官能团相似，且主要的峰值吸收带有3368—3428、2919—2926、1643—1653、1405—1421、1034—1058、528—606 cm-1。不同来源的腐殖质有类似的结构组成和官能团，结合前人的研究结果（徐玉坤等，2014；陈广银等，2008；孙文彬，2013），本研究中，3种处理样品在堆肥过程中的具体的红外光谱各主要吸收带的归属及其可能物质来源见表2。

图8 菌渣堆肥处理的红外扫描光谱Fig. 8 FTIR spectra of mushroom dregs composts

随着堆肥过程的进行，3种处理堆肥样品特征吸收峰的强度均发生不同程度的变化。从图7可以看出，虽然堆肥过程中3种处理的吸收峰相似，但各吸收峰的强度差异较大，随着堆肥过程进行，菌渣+豆渣处理（C1）的堆肥样品在各吸收带的吸收峰强度逐渐增强；而菌渣+鸡粪处理（C2）的堆肥样品在各吸收带的吸收峰的强度总体呈逐渐降低的趋势，但在堆肥进行到第21天时各吸收峰的相对强度在整个过程中最大；菌渣处理（C3）的堆肥样品，堆肥初期（堆肥第3天）各吸收带吸收峰强度最弱，堆肥前期（9—15 d）各波段的吸收强度最大，堆肥中后期（21—43 d），各吸收带吸收峰的强度无明显变化，吸光强度介于堆肥前期两种强度之间。

特征峰强度的大小可以反映官能团含量的相对高低，吸收峰相对强度越强，说明官能团的含量越高。结合表2得出，C1处理在3368—3428 cm-1吸收带的相对强度逐渐增加，表明多糖类的小分子物质逐渐增加，由于加入了豆渣，样品中含有的-OH和-NH含量较多；而C2、C3处理在此处的吸收峰强度则逐渐降低，C2和C3处理中易降解的碳水化合物在微生物作用下矿化分解，加之堆肥过程中水分的损失，使得碳水化合物和水分中的-OH吸收降低。

在 2919—2926 cm-1处吸收带的相对强度增加，表明亚甲基和甲基含量的增加，堆肥中碳水化合物和木质素逐渐分解；吸收强度下降，说明堆肥过程中脂肪族含量降低。1600—1700 cm-1是苯环上的-C-C-和分子间或分子内形成氢键的羧酸中-C-O的伸缩振动吸收峰，在1643—1653 cm-1处吸收带相对强度增加，表明堆肥中木质素得到了一定的降解，堆肥的芳香性增加。1405—1421 cm-1处吸收带是碳水化合物和脂肪族化合物中 CH3-和-CH2-的弯曲振动峰，其变化与1643—1653 cm-1处吸收带相似。3种堆肥处理在1034—1058 cm-1处吸收带的强度有所增加，表明碳水化合物含量的增加，可能是生成一些类富啡酸类物质（陈广银等，2008）。528—606 cm-1处吸收带的强度变化幅度不大，后期相对有所增强，因为生成了一些性质稳定的硅酸盐类物质。

3种处理堆肥过程中含有的主要官能团相似，在堆肥的初始阶段，有机物料在微生物作用下降解产生小分子的有机物质，如多糖类物质，这些物质随着堆肥过程进行会被微生物进一步分解利用，有机物中不饱和结构的多聚化或联合程度增大，芳香结构物质与氨基基团有所增加，说明堆肥过程中有机物质的变化规律先是易被微生物降解的有机物产生小分子的多糖以及蛋白质，这些物质进一步被分解利用，进而进入堆肥第二阶段的易分解及难分解组分如木质素的分解，最后是腐殖质类物质的逐渐合成。但由于堆肥原料来源复杂，不同基团的吸收峰可能存在互相重叠干扰，单一的红外光谱很难准确反映堆肥进程中物质的化学结构变化，未来对堆肥过程中有机物成分、结构的变化特征研究还需更先进的技术手段。

表2 堆肥过程各处理红外图谱特征峰归属Table 2 Characteristic peaks of infrared spectra during Mushroom Residue composting

3 结论

在整个堆肥过程中，堆体的腐熟分为3个阶段，前两个阶段堆体温度相对较高，高温持续时间（＞50 ℃）达10 d以上。

堆肥结束时，堆体的pH值均在8.5左右，达到了堆肥腐熟标准（pH 8.0—9.0）；C/N值均低于20，达到了理想的腐熟要求；堆肥第21天时，3种处理的堆体GI值均超过50%，至堆肥结束，GI均在80%以上，堆肥完全腐熟；堆体EC值在堆肥过程中相对稳定，均在1.0—2.5 mS·cm-1范围内浮动，符合腐熟堆肥对EC的要求；腐殖酸总量、胡敏酸的含量及二者的比值呈增加趋势，有机物腐殖化程度增大。

红外光谱分析结果显示，3种处理堆体的官能团相似，堆肥进程中，小分子多糖类物质含量减少，有机物中不饱和结构的多聚化或联合程度增大，芳香结构物质与氨基基团有所增加，腐殖化程度增加。