一起由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒病原溯源

李晓路 遇 婷 廖 文 张 巍 何 颖 祝 琳

细菌性食物中毒是指进食用被细菌或其毒素所污染的食物而引起的急性中毒性疾病，临床表现为呕吐、腹痛、腹泻、发热，其具有潜伏期短、起病急、病例集中的特点[1]。因此及时查找致病因子并采取针对性措施是处置食物中毒事件的关键。2018年4月，我市某高校发生一起食物中毒事件，累计发病患者10 例，经流行病学调查发现患者有共同进餐史，于进食后2 h 左右出现恶心、呕吐、腹部不适、腹痛、腹泻等症状。所有患者发病前24 h 再无其他共同进餐史，通过分析患者临床症状、血常规检测结果，初步判断为细菌性食物中毒。本研究采用传统培养法在采集的食物、生产加工环节和患者呕吐物样本中分离出了5 株金黄色葡萄球菌，并对分离菌株进行了肠毒素、药物敏感性和脉冲场凝胶电泳（PFGE）溯源分析。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株食物中毒事件中分离的5 株金黄色葡萄球菌，菌株编号及来源分别为：AS12 来源于呕吐 物；AS13 来源于盖浇饭；AS14 来源于豆皮；AS15来源于熟鸡肉；AS16 来源于炒菜锅壁涂抹拭子；ATCC6538 金黄色葡萄球菌、沙门菌H9812 为实验室保存标准菌株。

1.1.2 主要仪器与试剂主要仪器：酶标仪（Anthos 2010）；脉冲场凝胶电泳仪，Gel Doc XR 凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）。

主要试剂：金黄色葡萄球菌肠毒素金标快速检测卡（北京陆桥技术股份有限公司）；SMaⅠ内切酶、琼脂糖、葡萄球菌溶菌酶、蛋白酶K（大连宝生物有限公司）；抗生素（中国药物研究所）。所有试剂均在有效期内使用。

1.2 方法

1.2.1 金黄色葡萄球菌肠毒素检测将食物中毒事件中分离的菌株分别接种到5 ml BHI 中，36 ℃培养24 h，取1 ml 培养液加入1.5 ml EP 管中，以10 000 r/min进行离心，时间5 min，取200 μl 上清液，加入等体积的样品处理液，混匀，向检测卡的3 个孔中每孔加入100 μl，按说明书要求15 min 后判定结果。同时以BHI 作为阴性对照进行此实验。

1.2.2 药物敏感试验采用美国临床与实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）推荐的微量肉汤稀释法进行药物敏感试验，确定致病菌最低抑菌浓度（mimimal inhibitory concentration, MIC）[2]。根据CLSI 推荐的药敏试验抗生素选择原则确定革兰阳性菌适用的抗生素：苯唑西林（Oxacillin, OXA）、万古霉素（Vancomycin, VAN）、四环素（Tetracycline, TET）、红霉素（Erythromyci, ERY）、氯霉素（Chloramphenicol, CHL）、克林霉素（Clindamycin, CLI）、环丙沙星（Ciprofloxacin, CIP）、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑（Trimethoprim, TMP/ Sulfamethoxazole, SMZ）。将菌悬液浓度调整至0.5 麦氏单位，细菌浓度相当于108 CFU/ml。取100 ml 稀释于10 ml CAMHB 肉汤中，混匀（约为1×106CFU/ml），向96 孔药敏板中加入菌悬液，每孔50 μl。同时做生长对照和空白对照，另外要用ATCC6538做标准菌株对照。36 ℃培养20～24 h 读取药敏试验结果。当生长对照孔中有明显生长，空白对照孔无菌生长，并且质控菌株的MIC 值在规定范围内结果才可接受。根据MIC 值和对应MIC 值的解释标准判断被测试菌株对抗生素敏感度（S）、中介（I）、耐药（R）。

1.2.3 PFGE 分子分型试验按照国家风险评估中心提供的2016年《食源性疾病监测工作手册》，制备菌悬液，加入葡萄球菌溶菌素制备PFGE plug，裂解，清洗plug，使用SmaⅠ限制性内切酶对金黄色葡萄球菌基因组DNA 进行酶切，沙门菌H9812 作为电泳Marker，制胶进行电泳[3]。14 ℃电泳19 h，EB染色，利用凝胶成像仪获取图像，运用Bio Numerics软件对DNA 指纹图谱进行聚类分析。

2 结果

2.1 金黄色葡萄球菌肠毒素结果

5 株金黄色葡萄球菌均产生A 型和C 型两种肠毒素。

2.2 药敏试验结果

1 株来源于呕吐物的菌株对ERY 耐药，对OXA、VAN、TET、CHL、CLI、CIP、TMZ/SMZ 均敏感；另外4 株来源于食物和生产加工环节的菌株对这8 种抗生素均敏感。见表1。

表1 MIC 解释标准及判定结果

2.3 PFGE 结果

5 株金黄色葡萄球菌经电泳凝胶成像，运用Bio Numerics 软件根据条带数量及位置对图谱进行聚类分析，结果见图1。可以看出分别来源于呕吐物、豆皮、熟鸡肉、炒菜锅壁涂抹拭子的4 株菌呈现出完全相同的分子带型，具有100%同源性；另外1 株来源于盖浇饭的金黄色葡萄球菌分子带型则不相同，与上述4 株菌株具有70.59%的同源性。

3 讨论

图1 来自食物中毒样品中的5 株金黄色葡萄球菌聚类 分析结果

金黄色葡萄球菌适应力强、极易在环境中生存，并且可以通过多种方式和途径污染食物。引起的食 物中毒在世界各国家占细菌性食物中毒的比例均较大[4]。我国20%～25%细菌性食物中毒病例由金黄色葡萄球菌引起[5]，是排在沙门氏菌和副溶血性弧菌之后的第3 大致病菌[6-7]。研究表明，造成金黄色葡萄球菌食物中毒的主要致病因子是肠毒素[8-9]。该菌一旦污染食品加工的任一环节，在适宜环境下，8～10 h甚至更短时间，便可大量繁殖并且产生肠毒素[10]。这种肠毒素采用一般的家庭烹饪方式无法将其灭活，100 ℃加热30 min 仍具有活性[10-13]，因此金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的概率较高。

本研究中食物中毒的5 株金黄色葡萄球菌均产生A 型和C 型肠毒素。产A 型肠毒素的金黄色葡萄球菌引起的食物中毒较多，是国际上及我国导致食物中毒菌株最常见的肠毒素类型[5,8-9,14]，食物中毒事件中70%以上金黄色葡萄球菌均产生一种或多种肠毒素[15]。药敏试验结果显示食物中毒污染菌株中1 株来源于呕吐物对ERY 耐药，对OXA、VAN、TET、CHL、CLI、CIP、TMZ/SMZ 均敏感。另外4 株来源于食物和生产加工环节的菌株对这8 种抗生素均敏感。鉴于目前金黄色葡萄球菌对部分抗生素产生耐药性，临床治疗使用抗生素应结合药敏试验结果，以达到更好的治疗效果，亦能减少耐药菌株出现。

PFGE 是以核酸分析为手段的检测细菌染色体结构特征的基因分型技术，具有重复性好、特异度高、结果容易判断的优点，且不受细菌表型性状干扰，被认为是细菌分子流行病学研究的“金标准”。在国外该技术被广泛应用于食源性致病菌的病例监测、分子流行病学研究及暴发疫情的处理过程中，在疫情控制方面可发挥重要作用[16-19]。本研究中，2 株食物来源和1株生产加工环节来源菌株与1 株患者来源菌株100%同源，表明该种食物与此次食物中毒直接相关，另外1 株食物来源菌株与患者来源菌株70.59%同源，表明这种食物与此次食物中毒可能相关。由此可以断定本次食物中毒是因为豆皮和鸡肉中污染了金黄色葡萄球菌，烹炒加工过程中炒菜锅也受到了该菌的污染，但是普通的烹饪方式并没有将其消除，以至于发生了此次食物中毒事件。盖浇饭中检出的金黄色葡萄球菌与患者来源的菌株同源性没有达到100%，可能与此次检测过程中同一来源样品只溯源1 株菌有关，如果多溯源几株菌株，结果可能会有所不同。

此次将PFGE 分子分型技术应用于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件中在本地区尚属首次。通过PFGE 将来源于患者、食物和生产加工环节样本中检出的金黄色葡萄球菌串联在了一起，展示了其的遗传关系，揭示了样本之间的流行病学关系，明确地展示出了传染源和传播途径，为相关部门处理此次事件提供了强有力依据。