铁死亡与肝脏疾病

李运淇，严文静，王 雯*

(1.首都医科大学2017级四年制医学实验技术专业，北京 100069；2.首都医科大学基础医学院生理学与病理生理学系，北京 100069)

1 铁的代谢

1.1 铁的吸收与利用

铁是体内一种必需的微量元素。机体从食物中获取的铁主要为Fe3+，其在胃酸或十二指肠上皮细胞膜中的细胞色素b(D-cytb)的作用下被还原为Fe2+。随后Fe2+通过二价金属离子转运蛋白(divalent metal transporter 1，DMT1)被十二指肠和空肠吸收进入小肠上皮细胞内[1]。在小肠上皮细胞基底膜的铁转运蛋白(ferroportin 1，FPN1)和膜铁转运辅助蛋白(hephaestin，HP)的介导下，Fe2+被氧化成Fe3+，并被转运到血液中，Fe3+进而与转铁蛋白(transferrin，Trf)结合通过血液循环供给其它组织器官利用[2]。与Trf结合的Fe3+在转铁蛋白受体(transferrin receptor 1，TfR1)的介导下通过胞吞的方式被摄入到细胞内，并储存于铁蛋白(ferritin)中，以供细胞正常的生理活动之用。

1.2 铁稳态代谢的分子调控机制

体内铁稳态的调节对于铁的吸收与利用起着至关重要的作用。细胞内铁稳态受铁调节蛋白(iron-regulatory proteins，IRPs)-铁反应元件(iron-responsive element，IRE)的调节，而系统性铁稳态受铁调素(hepcidin)-FPN轴的调控。IRPs通过与铁蛋白和FPN1的mRNA结合，从而对细胞内铁稳态进行调节。hepcidin是肝细胞分泌的成熟激素肽，可以调控小肠上皮细胞对铁的摄取以及巨噬细胞对铁的释放，从而对体内铁稳态进行调控。铁蛋白对于细胞内铁的贮存和利用尤为重要。在哺乳动物细胞中，铁蛋白组装成大分子配合物，具有可容纳多达4 500个铁原子的腔室，在细胞内具有调节铁的生物利用度和解毒的作用。

2 铁死亡及其在肝脏疾病中的作用

2.1 铁死亡是铁依赖性的新型细胞死亡方式

铁死亡(ferroptosis)是由Stockwell等人在2012年首次提出的一种铁依赖性的新型细胞死亡方式[3]。铁死亡发生的分子机制主要是基于芬顿反应，在此反应中，细胞内游离的Fe2+与H2O2发生反应生成Fe3+，并使得多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)发生脂质过氧化，最终介导生物膜发生氧化损伤，促使细胞死亡。最近有研究发现辅酶Q10(CoQ10)会捕获介导脂质过氧化作用的脂质过氧化自由基，而铁死亡抑制蛋白1(ferroptosis suppressor protein 1，FSP1)作为一种氧化还原酶，能够通过还原CoQ10抑制脂质过氧化[4]。FSP1独立于GPX4谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase 4，GPX4)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)调节系统，可以抑制铁死亡的发生[4]。铁死亡的形态特征是线粒体体积缩小、外膜破裂、线粒嵴减少或消失[5]；其生化特点表现为细胞内铁和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的大量积累，产生过度的氧化应激以及膜脂质过氧化反应[6]。

2.2 铁死亡机制的关键调节因子

胱氨酸/谷氨酸反向转运体(system Xc-)在铁死亡中起着关键的作用。system Xc-主要介导细胞外的胱氨酸转运到细胞内，同时排出细胞内的谷氨酸。随后，胱氨酸可以转化为半胱氨酸，用于内源性抗氧化剂GSH的合成。最后，GPX4利用GSH清除细胞内过量的ROS，减少毒性脂质过氧化物(L-OOH)的含量，并将其转化成无毒脂醇(L-OH)。Erastin(Ⅰ型铁死亡激活剂，system Xc-抑制剂)和RSL3(Ⅱ型铁死亡激活剂，GPX4抑制剂)可以激活铁死亡的发生。近年来一些铁死亡抑制剂也相继被发现。Ferrostatin-1(Fer-1)和Liproxstatins可以抑制脂质过氧化并减少ROS的产生；包括去铁胺(deferoxamine，DFO)在内的诸多铁螯合剂可以抑制芬顿反应，减少细胞内ROS的生成，抑制脂质过氧化的发生，进而抑制铁死亡的发生。此外，铁蛋白也是一种重要的铁死亡负向调控因子。由于细胞衰老使得细胞内铁蛋白降解受到抑制，铁蛋白大量积聚，可使得细胞对铁死亡的敏感性下降[7]。

2.3 铁死亡与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)

HCC是肝癌中最为常见的一种，在全球男性癌症死亡率中居于第二。索拉非尼是一种多激酶抑制剂，也是第一种用于治疗晚期HCC的药物，并且可以显著延长HCC患者的生存期，索拉非尼可以通过诱导氧化应激和铁死亡等方式促使癌细胞死亡，并且这种死亡方式可被铁死亡抑制剂Fer-1完全阻断[8]。因此，索拉非尼可以诱导肝癌细胞发生铁死亡，从而起到治疗HCC的作用。

在肝癌细胞发生铁死亡的过程中，p62-Keap1-NRF2通路起着关键作用。目前p62-Keap1-NRF2对HCC中铁死亡的具体调节机制已被阐明[9]：当细胞癌变时，p62可以通过调节Keap1降解，激活NRF2转入核内；进而激活下游调节铁和ROS代谢相关基因的表达，抑制铁死亡的发生。此外，NRF2还通过胱硫醚酶途径诱导促进铁死亡的重要负向调节因子金属硫蛋白(MT1G)的表达，导致癌细胞对索拉非尼耐药[10]。

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)蛋白是真核细胞中调节各种基因转录功能的蛋白家族的成员，在多种癌症中为一种肿瘤抑制蛋白，其与肝肿瘤的发生和肝癌细胞铁死亡的发生均密切相关。有研究表明，索拉非尼刺激下，RB蛋白表达水平降低的HCC细胞死亡率是RB蛋白表达水平正常细胞的2～3倍，这表明RB蛋白表达水平降低的HCC细胞对索拉非尼诱导的铁死亡更加敏感[11]。此外，RB蛋白的失活可通过增加线粒体中ROS的产生，进而增强了细胞的氧化应激反应，而这可能是RB蛋白调节肝癌细胞铁死亡的关键机制[11]。因此，铁死亡可能是治疗HCC的一种新策略，而NRF2和RB蛋白可能是未来治疗HCC的关键靶点。

2.4 铁死亡与肝纤维化(liver fibrosis)

肝脏纤维化是多种病因所致的慢性肝脏损伤后发生的肝内结缔组织异常增生性疾病，长期发展会导致肝硬化，是常见的致死病因之一。目前，除肝脏移植外，针对肝纤维化及肝硬化尚缺乏有效的治疗措施。星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的激活是肝纤维化形成的基础之一，在肝损伤因素的驱动下，静止的肝星状细胞转分化为能够产生基质的成纤维细胞，随后导致肝纤维化。

近年来有研究发现铁死亡与肝纤维化有着密切的联系，在肝纤维化大鼠模型中，异甘草酸镁(MgIG)治疗可显著减轻肝脏损伤并减少纤维化瘢痕形成[12]。MgIG可以通过促进铁和脂质过氧化物的积累而诱导HSC发生铁死亡，从而起到抗纤维化的作用；而通过Fer-1抑制HSC铁死亡则完全消除了MgIG的抗纤维化作用[12]。同样有研究证实RNA结合蛋白(ELAVL1/HuR或ZFP36/TTP)介导的HSC铁死亡需要通过HSC中的自噬信号传导途径(铁蛋白自噬)来调节，上调ELAVL1和下调ZFP36可以促进索拉非尼诱导的HSC铁死亡，从而改善小鼠肝纤维化[13-14]。

最近的一项研究表明肝脏Trf通过调控铁死亡可以抑制肝脏损伤、纤维化及肝硬化发生[15]。研究人员构建了肝细胞Trf基因敲除小鼠(Trf-LKO)模型以及肝细胞Trf基因和Slc39a14基因双敲除小鼠(DKO)模型，并发现Trf-LKO小鼠表现为肝脏非转铁蛋白结合铁(non-transferrin-bound iron，NTBI)蓄积以及肝纤维化的病理特征，而双敲小鼠可显著减少肝脏NTBI的蓄积，从而减少由高铁饮食或CCl4注射引起的铁死亡以及肝脏纤维化。以上结果充分阐明了肝脏Trf缺乏通过铁死亡促发肝纤维化的分子机制，明确了Slc39a14是组织器官铁离子过载的转运蛋白，并且为肝脏纤维化的治疗提供了新的靶点。

2.5 铁死亡与酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)

ALD是以肝脂肪变性、脂肪性肝炎和肝纤维化为特征的一种肝脏疾病，也是目前全世界主要的健康隐患之一，其对肝脏的损伤最终可能发展为肝硬化甚至肝癌。乙醇在肝脏的代谢过程中会产生大量活性极高的乙醛、脂肪酸乙酯、磷脂酰乙醇和ROS。这些代谢产物可以阻碍细胞正常的生理功能，如蛋白质稳定、脂肪生成、线粒体呼吸和氧化还原平衡，导致肝细胞死亡。有研究[16]报道肝脏铁超载与ALD有关，其主要机制是长期大量饮酒可降低肝脏中hepcidin的表达，进而可通过增加十二指肠DMT1和FPN表达从而增加十二指肠对铁的吸收。Sirtuin1(SIRT1)是一种组蛋白去乙酰化酶，可通过修饰组蛋白和转录因子来调节脂质的代谢。经长期乙醇喂养后，与对照组(即野生型)小鼠相比，肠道SIRT1缺失(SIRT1iKO)的小鼠的肝脏损伤和肝脏炎症显著减轻。SIRT1iKO小鼠的这种保护作用可能是由于减轻铁代谢功能障碍，提高GSH含量，减轻脂质过氧化而造成的[17]。此外，在脂肪特异性脂质-1过表达的酒精性脂肪性肝炎小鼠(Lpin1-Tg)模型中，Lpin1-Tg小鼠表现出脂肪变性、炎症增强、肝胆侵犯性损伤和肝纤维化。乙醇喂养Lpin1-Tg小鼠则表现为更为严重的肝炎和大量铁积累、铁分布异常、谷胱甘肽水平降低、MDA水平升高并引起脂质过氧化[18]。这些结果都表明铁死亡在ALD中发挥关键作用，同时也为探索ALD的发病机制提供了新的思路。

2.6 铁死亡与非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)

目前，NAFLD已成为全世界慢性肝病和HCC的主要原因。NAFLD包括单纯性肝脂肪变性以及非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)，其特征是肝细胞中脂滴的积累、细胞死亡以及免疫/炎性细胞浸润和一定程度的纤维化。有研究[19]发现一些NASH患者表现为肝脏铁积聚，这种由代谢异常引起的铁积累可能会加剧NASH的进程，而服用维生素E治疗后可以抑制NASH患者的脂质过氧化并降低血清转氨酶水平，减少肝脂肪变性，从而改善NASH。在蛋氨酸/胆碱缺乏饮食(MCD)诱导的NASH小鼠模型中，给予RSL3后发现肝脏脂肪变性有所加剧，而给予用亚硒酸钠(GPX4激活剂)、DFO或Fer-1治疗，NASH严重程度显著降低[20]。此外，NASH患者血清铁蛋白水平升高与疾病严重程度有关，并且血清铁蛋白是NAFLD患者晚期肝纤维化的独立预测因子[21]。最近有研究表明，在缺乏胆碱、补充乙硫氨酸(CDE)饮食的NASH小鼠模型中，铁死亡是引发NASH的先发事件，并且铁死亡的发生先于其它类型的细胞死亡[22]。两种铁死亡抑制剂奎诺二甲基丙烯酸酯(Trolox)和去铁铜(deferiprone，DFP)可抑制此模型鼠肝脏细胞的铁死亡，并抑制了随后的免疫细胞浸润和炎症反应[22]。以上研究结论均证实了NAFLD与铁死亡的发生有关，并且对铁死亡的抑制将可能成为治疗NAFLD的新方案。

2.7 铁死亡和药物引起的肝损伤(drug-induced liver damage，DILI)

DILI是急性肝功能衰竭(acute liver failure，ALF)的主要病因，对乙酰氨基酚(APAP)则是最为常见的引发ALF的药物。APAP在细胞色素p450的作用下产生高反应性和高毒性的代谢产物N-乙酰基-对-苯醌亚胺(NAPQI)，从而引起对肝脏的毒性，GSH可以与NAPQI结合进而排毒。因此过量服用APAP后，肝中会生成大量的NAPQI，进而造成GSH的耗竭。如前文所述，GSH对于铁死亡的发生起着至关重要的作用，因此这也暗示铁死亡可能参与到APAP引起的肝损伤。

在最近的一项研究中，APAP处理的小鼠原代肝细胞接受Fer-1治疗后细胞存活率提高[23]。由于Fer-1对CYP2E1(细胞色素P450同工酶)没有影响，因此可以推断其对APAP诱导细胞死亡的保护作用与铁死亡相关途径被抑制有关[23]。同样有研究进一步发现Fer-1和DFO可以通过抑制脂质过氧化和GSH耗竭而降低APAP诱导的急性肝衰竭小鼠的死亡率[24]。以上研究结果均表明铁死亡参与了DILI，并提示通过药物抑制铁死亡有可能成为临床治疗DILI的新策略。

3 结 语

除上述疾病外，铁死亡已被证实还与其它多种肝脏疾病有着密切的联系，如肝脏缺血再灌注损伤、病毒性肝炎和免疫介导的肝炎，以及疟原虫感染等。铁死亡通过产生ROS和脂质过氧化作用影响疾病的发生与发展，因此抑制铁死亡可用于预防和保护由于氧化应激、炎症反应和免疫原性介导的各种肝损伤，而诱导铁死亡可用于治疗耐药的恶性肿瘤和肝纤维化等肝脏疾病。

作为近年来新发现的一种铁依赖性细胞死亡方式，铁死亡的调节机制及其在一些肝脏疾病中的确切作用仍未完全阐明，而且目前仍没有检测铁死亡的特异性标记物。因此，对于铁死亡特异性标记物以及新的铁死亡激活剂、抑制剂的研发至关重要。铁死亡的确切作用似乎还与细胞类型和疾病背景有关，而从实验动物获得的结果能否可以顺利地转化为人类病理生理学的研究尚待阐明。因此，建立各种与铁死亡相关的肝脏疾病的实验动物模型将有利于进一步研究铁死亡在人类肝脏疾病中发挥的作用。综上所述，明确肝脏细胞铁死亡的具体机制将有助于理解各种肝脏疾病的发病机制，并为这些疾病的临床治疗提供新的策略。