稻曲菌素及其生物合成途径研究进展

胡元森，杨浩杰，谢澳文，韩一鸣，樊 磊，吕扬勇

河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001

稻曲菌素(Ustiloxins)是由稻绿核菌产生的一种具有较强细胞毒性的环肽类真菌毒素，该毒素能够通过抑制微管蛋白的组装和解聚从而抑制细胞有丝分裂，对人和动物细胞产生毒害作用；同时受到稻曲菌素污染的稻谷，质量明显下降[1-3]。由于稻曲菌素对细胞的毒性作用，使得其在农药(抗真菌、杀虫)和医药(抗肿瘤)领域也有广泛的用途[4-5]。近年来，随着分离纯化技术的进步，不断有新类型的稻曲菌素被发现[6-7]。同时研究发现，除稻绿核菌外，粮食储藏过程中常见的黄曲霉在一定的条件下也能合成稻曲菌素[8-10]。由于该毒素与食品质量安全及人类健康的密切关系，其理化性质、毒性、化学合成、生物合成及其调控机理的研究越来越受到重视。作者主要对稻曲菌素的类型、提取与检测方法、生物毒性、生物合成途径及其调控机理进行综述。

1 稻曲菌素的类型

截至目前，发现稻曲菌素共有6种类型，包括A、B、C、D、F、G，均被分离纯化并鉴定了结构。其中,稻曲菌素A、B、C、D、F最先被分离鉴定[1-2,6]，而稻曲菌素G在2017年由Wang等[7]从感染稻曲病的大米中分离得到，稻曲菌素G(C的类似物)和之前鉴定的5种毒素有着类似的结构，均具有手性烷基、芳香基醚和13元环肽的结构。在6种毒素中，稻曲菌素A和B是主要的成分，约占总量的90%[11]。

2 稻曲菌素的提取、分离纯化及检测

2.1 稻曲菌素的提取与分离纯化

吕仕琼等[5]对稻曲菌素A、B、C、D、F的提取与分离纯化方法做了详细的综述，提取方法主要包括甲醇提取法和硫酸铵沉淀法；纯化方法主要采用反相硅胶柱层析进行分离。Wang等[7]对新型稻曲菌素G的分离纯化进行了详细探讨，通过对甲醇、乙醇、丙酮和去离子水提取溶液的研究，发现去离子水提取效果最佳。在室温下，去离子水和大米假黑穗球以1∶3(kg/L)的比例剧烈震荡处理24 h，过滤后的滤液在60 ℃下进行旋转蒸发，得到含有稻曲菌素的残渣。采用大孔吸附树脂SP207层析，不同比例的乙醇-水为流动相，得到不同组分。然后采用半制备液相配备ODS柱和Sephadex G-15层析柱，不同比例甲醇-水(含有0.02%三氟乙酸)作为流动相，分离得到不同组分的纯品。

2.2 稻曲菌素的检测

目前针对稻曲菌素的检测方法有传统的薄层层析法、酶联免疫法(多克隆抗体)、高效液相色谱法以及近几年来广泛采用的高效液相色谱-质谱联用法以及单克隆抗体类酶联免疫法。由于A和B两种类型是稻曲菌素的主要组成部分，因此，目前方法主要针对这两种毒素进行检测。前3种方法针对的是稻曲菌素A，并且已有文献[5]综述，在此主要介绍后两种新建立的方法，能够同时检测主要的两种稻曲菌素A和B。

高效液相色谱-质谱联用法。Shan等[12]首次通过液质联用法(LC-ESI-MS)和高效液相(HPLC-UV)同时测定分析感染了稻绿核菌大米中稻曲菌素A和B的含量。首先采用液相质谱联用确定组分，再采用高效液相检测含量。简要流程如下：取一定量样品，去离子水抽提3次，上清液旋转蒸发得到残渣，取其中少部分经过离子交换处理后，液相-电喷雾质谱(LC-ESI-MS)检测确定样品组成。液相条件：Synergi reversed-phase Hydro-C18 柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流动相为甲醇-水(体积比为15∶85)含0.02%三氟乙酸，流速1.0 mL/min，紫外检测器检测波长220 nm。质谱条件：ESI正离子工作模式，扫描范围100～1 000m/z，压力35 psi(241.325 kPa)，干燥气体温度350 ℃，干燥气体流量8.0 L/min，毛细管电压3 500 V，总分析时长30 min。

酶联免疫法。陈美军等[13]、Fu等[14]采用单克隆抗体类酶联免疫吸附试验(icELISA)方法对水稻和饲料样品中的稻曲菌素A进行检测，简要流程如下：首先将大米假黑穗球粉碎并在室温下用去离子水萃取3次，水提取物旋转蒸发后经过大孔吸附树脂HP-20吸附, ODS-AQ、Sephadex LH-20和Sephadex G-15等柱层析，获得稻曲菌素A和稻曲菌素B纯品。使用戊二醛法将稻曲菌素A与BSA、OVA缀合以分别制备免疫原(UA-BSA)和包被抗原(UA-OVA)。然后免疫雌性Balb/c小鼠，产生并纯化获得单克隆抗体mAb 2D3G5，IC50为13.8 ng/mL，工作范围为2.8～72 ng/mL。在前期工作基础上，Fu等[11]最近成功开发出直接竞争酶联免疫吸附法(dc-ELISA)同时测定稻曲菌素A和B的总含量，简要流程如下：分别纯化得到稻曲菌素A和B，将稻曲菌素B分别通过戊二醛法与鸡卵白蛋白和牛血清蛋白结合制备抗原(UB-OVA/UB-BSA)，将稻曲菌素A与辣根过氧化物酶连接，经过免疫小鼠等一系列流程获得单克隆mAb 4C4F11，对稻米中稻曲菌素A和B的最低检测限分别为35 ng/g和100 ng/g。

3 稻曲菌素的生物活性

3.1 对微管蛋白的作用

吕仕琼等[5]对稻曲菌素A、B、C、D、F抑制微管蛋白的组装和解聚机理进行了详细综述，其中稻曲菌素A 对微管蛋白组装的半抑制浓度最低。稻曲菌素A对于微管蛋白的抑制机理在于阻断了β-微管蛋白中特定链内交联的形成，同时抑制了碘代乙酰胺对微管蛋白的烷基化作用，并且稻曲菌素 A能够强烈促进秋水仙碱与微管蛋白的结合[15]。Joullié等[16]采用化学合成手段获得了稻曲菌素D的4种类似物D1、D2、D3、D4，并研究了对微管蛋白聚合的影响。研究结果显示D1和D4对微管蛋白无抑制作用，其IC50大于40 μmol/L，这表明天然存在的稻曲菌素D大环大小是最合适的。D3表现出轻微的抑制作用，但其总的IC50也大于40 μmol/L。醚桥上立体碳去除后获得的稻曲菌素D2抑制效果较好，其IC50值为 (9.2±2.0) μmol/L。对稻曲菌素D与D2、D3的结构进行分子对接模拟结果显示，甘氨酸侧链发生了明显的扭曲，使其逐渐靠近缬氨酸残基。外部的甘氨酸侧链可能会降低分子在这个位置的结合能力，但也可能会阻碍与缬氨酸残基的结合能力，这对其发挥抑制作用极其关键。

3.2 对人体癌细胞的抑制作用

Koiso等[17]研究了稻曲菌素A和B对人的胃、肺、心脏、结肠和肾的癌细胞的抑制作用，结果显示两种毒素均能抑制供试的癌细胞。Wang等[7]采用紫杉醇为阳性对照(CK)，研究了稻曲菌素A、B、D、F、G对结肠癌细胞系(HCT116)、非小细胞肺癌细胞系(NCI-H1650)、胃癌细胞(BGC-823)、肝癌细胞(HepG2)、肺腺癌细胞(A549)以及黑色素瘤细胞(A375)系的毒性。结果显示稻曲菌素D、F和G对HCT116、NCI-H1650、BGC-823和HepG2表现出较弱的抑制活性，此外稻曲菌素G对细胞系A549和A375表现出弱活性，IC50值分别为36.5、22.5 μmol/L;稻曲菌素A对HCT116、NCI-H1650、HepG2抑制活性也较弱，对人肿瘤细胞系BGC-823和A549显示出中等活性，IC50分别为2.66、3.12 μmol/L；稻曲菌素B对A549抑制活性较差，它们的半抑制浓度IC50均超过了50 μmol/L，对 BGC-823细胞系抑制活性较好，而对HCT116、NCI-H1650和HepG2细胞系的抑制活性一般。

3.3 对种子萌发的抑制作用

研究表明，大米假黑穗球的水浸出液对水稻、玉米以及小麦等的胚芽和胚根生长均有抑制作用。Koiso等[17]研究了不同质量浓度的稻曲菌素A对水稻种子萌发的影响，结果显示当其质量浓度为100 μg/mL时，几乎完全抑制胚根和胚芽的生长。Wang等[7]以草甘膦为阳性对照，对分离纯化得到的稻曲菌素A、B、D、F、G对 “Lijiang”和 “Zhonghua11”两个水稻品种的种子胚根和胚芽伸长抑制活性研究发现：稻曲菌素A、B以及G对两类种子的胚根和胚芽的生长具有较强的抑制作用，同时3种毒素还能够引起水稻幼苗根系和胚芽的异常膨胀。结果显示，稻曲菌素A、B和G的抑制作用强于D和F，说明C-12侧链的亚硫酰基结构对于稻曲菌素发挥抑制作用具有重要影响。

4 稻曲菌素合成途径

4.1 化学合成途径

由于稻曲菌素具有作为抗肿瘤药物、杀虫剂等应用的潜力，其化学合成方法的研究也备受关注。在稻曲菌素家族中，D类型毒素是较简单的同系物之一，具有较高的生物活性，对其化学合成方法的研究可为其他化合物的合成提供骨架组成部分[18]。因此，目前稻曲菌素的化学合成主要集中在D类型的研究[19-21]，其合成途径已经由最初的20个化学反应发展到通过6个步骤的ammonia-Ugi 反应即可得到[22]。

4.2 生物合成途径及其调控机理

截至目前，稻曲菌素的合成途径及调控机制研究主要集中在黄曲霉中，特别是稻曲菌素B合成途径的研究。在此，主要以黄曲霉为对象进行介绍。依据催化酶的不同，可以将次级代谢产物分为聚酮合酶类(polyketide Synthases, PKSs)、非核糖体多肽酶类(non-ribosomal peptide synthetases, NRPSs)以及萜环化物(terpene cyclases)等[23]，比如黄曲霉产生的黄曲霉毒素、震颤毒素等属于PKS类型的化合物[24]。根据稻曲菌素由多个非蛋白类的氨基酸组成的特点，最初认为其属于NRPS类型的化合物。采用基于基序从头检测算法(motif-independent de novo detection algorithm, MIDDAS-M)对黄曲霉中基因序列进行分析，发现其合成途径中的酶并不存在NRPS所具有的特异性催化结构域，如PCP、TE等结构域，而是属于核糖体合成和翻译后修饰肽类(Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides, RiPPs)化合物[8]。该类化合物在细菌中较为常见，如1998年发现的枯草菌素等[25-26]；在真菌中，只有白毒伞蘑菇中的两个化合物α-amanitin和phallacidin的结构被鉴定[27]。在子囊菌中，目前只有黄曲霉中的稻曲菌素合成途径得到鉴定[8-10]。

稻曲菌素的生物合成途径包含了一系列的酶促反应过程，涉及多个基因，分布在基因组30 kb范围内。这些基因编码了稻曲菌素前体蛋白、两个氧化酶、依赖于腺苷甲硫氨酸的甲基转移酶、细胞色素P450单加氧酶、两个含黄素单加氧酶、半胱氨酸脱硫酶以及C6类型的途径特异性转录因子等。以下对生物合成途径涉及的主要酶及基因做详细介绍。

稻曲菌素前体蛋白(ustA，基因号AFLA_094980)：尽管RiPS类型化合物合成途径各异，但是都存在一个前体蛋白。在黄曲霉中ustA编码该蛋白合成，该序列包含16个重复短肽“YAIG”，是合成稻曲菌素的基本单元。短肽的C端和N端分别包含相似的序列，该序列可能为ustP1、ustP2和ustH编码肽酶的识别位点。目前已知的RiPS前体蛋白中只含有一个核心肽，而黄曲霉中多个重复肽段的存在可能有助于稻曲菌素产量的提高[8]。

酪氨酸酶(ustQ, AFLA_095060)与两个氧化酶(ustYa, AFLA_094990和ustYb, AFLA_095020)：ustQ与ustYb基因单独缺失之后，稻曲菌素B仍有少量产生；ustYa和ustYb同时缺失之后，稻曲菌素F合成被阻断，表明这3个基因促进了氧原子与酪氨酸芳香环以及异亮氨酸侧链的交联，共同参与了环肽中间体的形成。其中ustYa和ustYb编码的酶均含有“HXXHC”基序，可能是该酶的活性中心[10]。

甲基转移酶(ustM, AFLA_095100)、细胞色素P450单加氧酶(ustC, AFLA_094960)、黄素单加氧酶(ustF1, AFLA_094950; ustF2, AFLA_095050)以及依赖于5′-磷酸吡哆醛(PLP)酶(ustD, AFLA_095040): 通过甲基转移酶和单加氧酶催化的氧化还原反应，将甲基和硫元素添加至侧链，然后在黄素单加氧酶的催化下，通过两轮N-羟基化反应以及脱羧脱水反应得到中间化合物，类似的反应过程也存在于浅蓝霉素A的合成过程中[28]。ustD主要催化天冬氨酸脱羧生成烯胺。

研究表明，稻曲菌素生物合成途径受到Zn(II)2Cys6 (C6)类型的途径特异性转录因子ustR、枯草杆菌蛋白酶类似的内切蛋白酶kexB以及全局调控因子LaeA的调控。在黄曲霉中，通过将ustR的启动子更换为TEF1基因启动子后，其转录水平提高了15倍，稻曲菌素B的产量提高了4.8倍[8]。

在黄曲霉和稻绿核菌中，稻曲菌素前体蛋白ustA的N端均含有进入内质网的信号肽，C端含有一个碱性氨基酸的重复序列“KR”，这与酿酒酵母中内切蛋白酶kex2的作用位点类似[29]。在酿酒酵母中，kex2编码了依赖于Ca2+的跨膜丝氨酸蛋白酶，能够水解KR的羧基侧链[30]。在米曲霉中，kex2同源基因kexB参与前体蛋白处理得到了验证，在一株缺失kexB基因且对ustR进行过量表达的菌株(ustREX/ΔkexB)中，虽然ustR转录水平得到了增强，但是产物中检测不到稻曲菌素B。为了进一步验证kexB的作用，同时构建了米曲霉10个蛋白酶缺陷株和ustR过量表达菌株(ustREX/ΔP10)，结果表明与单独过量表达ustR的菌株相比(ustREX)，二者产生的稻曲菌素含量相同，表明kexB对于稻曲菌素的合成是必须具有特异性[31]。根据此研究结果，Umemura等[8]完善了kexB调控稻曲菌素的合成途径，首先ustA蛋白在经由内质网被转运到高尔基体的过程中，必须经过kexB对其C端的“KR”进行识别并切割，在此过程中还需要另外两个丝氨酸肽酶ustP和ustH的协助;然后在ustQ等酶催化下经过甲基化、环化等反应，形成中间产物稻曲菌素F;最后在ustM、ustD等作用下经过脱羧、脱水机缩合等反应形成稻曲菌素B。

LaeA 作为全局性调控因子广泛存在于黄曲霉、红曲霉、稻瘟菌等丝状真菌中，对黄曲霉毒素、青霉素等多种次级代谢产物具有调控作用[32]。Lv等[33]最近通过对黄曲霉野生型菌株和LaeA缺陷型菌株蛋白组学研究发现，与野生型相比，包括稻曲菌素合成前体ustA在内的4种酶(ustH、ustM和ustD)的表达量均出现了大幅度的下调，含量分别为野生型的0.13、0.46、0.34和0.22，表明LaeA可能参与了稻曲菌素合成的调控。

5 展望

目前，稻曲菌素的研究主要集中在新结构的分离鉴定、毒性分析、化学合成及新的检测方法的建立，并且取得了较大的进展。然而稻曲菌素生物合成途径及其调控机制的研究还处在初级阶段，主要集中在生物合成途径中结构基因的功能研究，仍然停留在基因组水平。研究表明，胞外多种环境因子如温度、湿度、水分活度等,营养元素如碳源、氮源、无机盐等,相关蛋白在转录水平、翻译水平以及翻译后修饰水平(甲基化、乙酰化、磷酸化、SUMO化、巴豆酰化等)的调控对次级代谢的产生均具有显著的影响[34-36]，而稻曲菌素在这些方面的调控研究鲜有报道。笔者认为在这些方面开展工作，不但有利于进一步阐明稻曲菌素的生物合成途径及其调控机理，对于制定新的、有效的策略对稻绿核菌进行生物防控以期阻断稻曲菌素的污染具有重要的现实意义。