芦荟大黄素对便秘小鼠结肠肌电表达的影响

王健 朱甲婧 孙嘉翊 王婷 杜爱林

便秘是一种常见的胃肠运动障碍性疾病。由于各种因素(饮食，年龄，地理分布，居住区域，职业等)影响，便秘发病率近几年来呈上升趋势[1]，大黄素具有抗肿瘤活性、抗微生物生长作用、免疫抑制作用和泻下利尿作用[2]。芦荟大黄素(aloe emodin，AE)与大黄素是同分异构体，AE也有抗肿瘤活性、抗菌活性、免疫抑制和泻下作用[3]。目前现有文献仅局限于肿瘤活性，对泻下有关的作用在国内还未报道。已有研究表明：P物质(P substance，SP)、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)可作为作为胃肠运动调节中重要的兴奋性和抑制性胃肠肽，广泛分布在胃肠道中[4]。SP是兴奋性神经递质，能刺激肠道运动并抑制胃肠道黏膜分泌[5]。血管活性肠肽是肠神经系统(ENS)中的一种抑制性神经递质，能够松弛胃肠道，是参与肠蠕动调节的重要蛋白。SP是兴奋性神经递质，能刺激肠道运动并抑制胃肠道黏膜分泌[5]。因此本课题将进一步研究AE对结便秘小鼠肠组织中SP及VIP表达的影响，探究其治疗便秘的作用机制，同时为新药开发提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 动物 取30只小鼠，平均分为三组，对照组、模型组、AE组，10只/组。

1.2 实验试剂 复方地芬诺酯片(江苏平光制药有限责任公司，批号：170032，2.5 g/片)，硫酸钡混悬液(美仑生物，CAS号：7727-43-7)，乌拉坦腹腔注射麻醉(0.3 mL/只)，AE(美仑生物，批号：N1026A)等。

1.3 主要仪器 BL-420F生物机能试验系统，自制铜丝电极直径0.5 mm，长度4 mm，注射器、灌胃针头、电子秤、电热板、计时器、眼科剪、刻度尺、镊子、量筒、烧杯等。

1.4 造模 取30只小鼠适应性喂养1周后，测量每只小鼠连续4 d饮水量及大便量，计算此批小鼠正常每日饮水量均数，得出每日大便量的正常范围，然后开始限水加给药物进行造模。给药方法：将药物混入蒸馏水中给小鼠进行灌胃。给药量：复方地芬诺酯片25 mg/kg(小鼠用量按成人用量的9倍计算)。限水水量：于第1～2天给前1周平均水量的1/6，第3～6天给前1周平均水量的1/3，取整数值。为了避免再次灌胃操作对小鼠排便的影响，我们对小鼠实行普通饮水瓶手持辅助饮水方法。2次/d给水。对照组灌胃等量的蒸馏水，排除灌胃操作带来的影响干扰。记录每日排便量、粒型大小、干燥程度。以粪便干燥、粒形缩短、排便费力、日排量低于参考值范围为诊断小鼠便秘的标准。

1.5 对小鼠肠道传输功能的检测 对小鼠大便情况的测定：配制140%的硫酸钡混悬液。停药7 d后，禁食14 h，用硫酸钡混悬液按1 mL/100 g的剂量给小鼠灌胃并准确计时，给药后观察小鼠第一次排出白便的时间，连续观察6 h，记录小鼠排便的粒数，粪便的干重(收集的粪便在25～27 ℃的电热板上烤6 h)。结肠肌电生理变化测定：首先禁食小鼠24 h，注射20%乌拉坦腹腔麻醉(0.3 mL/只)，而后将其仰卧置于手术台，常规消毒，纵行沿下腹部正中切开1.5 cm，显露回盲部，于距盲肠约1 cm(结肠近段)放置一对铜丝电极(两电极插入浆肌层内，彼此相距0.5 cm)，导线经切口引出接BL-410F生物机能实验系统，于30 min后开始记录。灵敏度选择：增益倍数放大500倍、高频滤波为20 Hz、时间常数0.001 s，连续记录45 min，重复3次。

1.6 结肠肌电活动参数分析 以3 min为1个时间段，分别记录比对振幅和频率的平均值、标准差以及变异系数。

慢波振幅变异系数(%)＝慢波振幅标准差/慢波振幅均值×100%

慢波频率变异系数(%)＝慢波频率标准差/慢波频率均值×100%

1.7 免疫组织化学技术 各组小鼠均只给予水24 h，对于小鼠进行麻醉处死，通过腹腔注射的方法，注射5%水合氯醛(0.1 mL/10 g)，之后取小鼠近段结肠，用4%的多聚甲醛溶液固定小鼠的组织，一定梯度的乙醇脱水，石蜡包埋，切片，切片厚度为5 μm。常规脱蜡复水，采用DAB染色，把二抗稀释为200倍，最后使用树胶封存玻片晾干。在显微镜下观察SP和VIP的染色情况，阳性细胞的判定方法，以细胞中存在有被染为褐色的颗粒为标志。选择合适的视野，避开重叠或者不完整的，用Image pro-Plus 6.0软件统计分析每个视野的平均光密度值。

1.8 统计学处理 用照相系统在光镜下采集免疫组化图片，用Image pro-Plus 6.0软件统计平均光密度值，SP和VIP表达情况用Excel进行统计分析，用(±s)表示。

2 结果

2.1 三组小鼠排便情况的测定(表1) 建模后，AE组及模型组小鼠的粪便较对照组小鼠的粪便重量减轻、湿度降低、硬度增大。模型组小鼠及AE组小鼠6 h内排便粒数较对照组较大幅度减小，第一次排红便时间长，差异有高度统计学意义(P＜0.01)。

表1 三组小鼠排便情况的测定(±s)

表1 三组小鼠排便情况的测定(±s)

注：与对照组比较，#P＜0.01。

组别例数第一次排红便时间/min 6 h排便粒数对照组10174.38±7.5973.89±6.56模型组10379.56±23.17#29.51±6.02#AE组10220.12±13.87#65.25±5.77#

2.2 三组小鼠结肠肌电活动(表2，图1) 三组小鼠的结肠慢波呈正弦波样曲线。三组小鼠的结肠慢波表现与正弦波样曲线相接近。模型组结肠慢波频率为(47.97±2.63)次/min，与对照组(43.75±0.69)次/min相比明显加快，差异有高度统计学意义(P＜0.01)，AE组结肠慢波频率与模型组比较明显减慢，差异有高度统计学意义(P＜0.01)；模型组结肠慢波频率变异系数(6.02±0.23)%，与对照组(1.83±0.38)%相比明显增大(P＜0.01)，AE组小鼠频率变异系数(2.77±0.19)%，与模型组相比更趋于正常(P＜0.01)；模型组结肠慢波振幅(0.05±0.03)mV，与对照组(0.16±0.03)mV相比显著减少(P＜0.01)，AE组振幅(0.13±0.03)mV，与模型组相比明显回升(P＜0.01)；模型组结肠慢波振幅变异系数(62.79±1.71)%，与对照组(10.13±0.55)%相比明显增大(P＜0.01)，AE组小鼠振幅变异系数(25.31±1.97)%，与模型组相比明显减小(P＜0.01)。

表2 三组小鼠结肠慢波频率、振幅比较(±s)

表2 三组小鼠结肠慢波频率、振幅比较(±s)

注：与模型组比较，#P＜0.01。

组别例数频率/(次·min-1)频率变异系数/%振幅/mV振幅变异系数/%对照组1043.75±0.69#1.83±0.38#0.16±0.03#10.13±0.55#模型组1047.97±2.636.02±0.230.05±0.0362.79±1.71 AE组1043.84±1.19#2.77±0.19#0.13±0.03#25.31±1.97#

图1 三组小鼠结肠肌电图(A：正常组小鼠结肠肌电图；B：模型组小鼠结肠肌电图；C：AE组小鼠结肠肌电图)

2.3 三组小鼠结肠SP表达变化(图2A～2C，表3)与正常对照组比较，模型组小鼠结肠SP表达明显降低，差异有高度统计学意义(P＜0.01)；AE组与模型组比较，差异有高度统计学意义(P＜0.01)。

图2A 对照组小鼠结肠SP 阳性表达免疫组化DAB染色(×40)

图2B 模型组小鼠结肠SP 阳性表达免疫组化DAB染色(×40)

图2C AE组小鼠结肠SP 阳性表达免疫组化DAB染色(×40)

表3 三组小鼠结肠SP 表达变化(±s)

表3 三组小鼠结肠SP 表达变化(±s)

注：与模型组比较，*P＜0.01。

组别例数结肠中SP平均光密度值对照组100.045 2±0.007 0*模型组100.023 1±0.004 9 AE组100.040 5±0.002 2*

2.4 三组小鼠结肠VIP表达变化(图3A～3C，表4)与正常对照组比较，模型组表达明显降低，差异有高度统计学意义(P＜0.01)；AE组与模型组比较，差异有高度统计学意义(P＜0.01)。

图3A 对照组结肠组织VIP 的阳性表达免疫组化DAB染色(×40)

图3B 模型组结肠组织VIP 的阳性表达免疫组化DAB染色(×40)

图3C AE组结肠组织VIP 的阳性表达免疫组化DAB染色(×40)

表4 三组小鼠结肠组织中VIP 平均光密度值(x±s)

3 讨论

便秘是一种常见的胃肠运动障碍性疾病。在临床中，便秘是一种很常见的症状，但目前国内外文献并没有对其病因有明确说明和解释。

有研究表明[6]，便秘患者结肠推进性收缩波数目和收缩幅度均有所减低，粪便在肠道有所潴留。结肠能促进排泄粪便，便秘常被认为是结肠动力异常引起的。结肠的肌电动作电位是在慢波的基础上产生的，与平滑肌收缩频率相同，是推进性运动的核心动力。结肠的动力情况可由结肠肌电活动，电生理指标进行客观显示。研究表明：慢波作为可控制肠道收缩节律的一种周期性电活动是相对规律而稳定的，肠道收缩或否，慢波始终存在[7]。

本实验通过使用复方地芬诺酯建造小鼠的便秘模型，用AE对小鼠进行灌胃治疗1周后，结果显示：模型组与对照组小鼠比较，6 h大便量减少，推动率降低，说明便秘模型建立成功。而AE组与模型组相比，第一次排红便时间减少，6 h大便量增多，推动率增加，说明AE对便秘小鼠有通便的作用。模型组与对照组小鼠相比，慢波振幅减少且慢波振幅变异系数增大，慢波频率增快且慢波频率变异系数增大，振幅和频率皆有极大差异。该现象的发生提示便秘有可能是因为动作电位产生受阻从而削弱了肠道的传输能力，而AE组与模型组小鼠相比，其慢波频率减少，慢波振幅小幅度上升。此外，为了衡量节律的稳定性，我们应用了变异系数这一参数来反映同组小鼠不同时间段振幅和频率的差异[8]。结果 显示，便秘小鼠的慢波振幅变异系数及慢波频率变异系数与对照组相比均有所增长，该结果提示便秘小鼠的结肠肌电生理活动出现了一定程度上的紊乱。AE作用于便秘小鼠后其慢波振幅变异系数及慢波频率变异系数较之前明显趋于正常，提示AE对增加便秘小鼠的结肠推进性收缩波数目有一定的作用。收缩幅度的提升可使粪便在结肠中排泄的速度加快，能有效缓解结肠的动力异常。但AE在有效改善便秘的同时，是否能够长久持续稳定地增加收缩波的数目而导致肠道收缩节律的紊乱，目前尚无定论，仍需进一步研究。

SP为一种重要的神经肽，广泛地分布于肠神经系统和整个胃肠道，既可以激素的形式，也可作为神经递质参与胃肠道运动的调控[5]。在肠道神经丛及神经元中存在着SP这种蛋白，它作为一种具有兴奋作用的神经递质，能够调节肠道的运动。一些研究者发现，产生便秘的原因和SP的多少有关系，且SP越少较容易产生便秘[9-10]。SP属于胃肠肽中的速激肽族，具有强烈地促进消化道平滑肌收缩、刺激结肠黏膜分泌水和电解质，促进胃肠蠕动的作用。已有研究表明，80%的便秘患者结肠平滑肌中缺乏SP[11]。

VIP是肠神经系统中最具代表性而且研究得比较深入的神经递质，在胃肠调节中起重要的作用。其受体广泛分布于人和动物的多种组织器官上[12]。VIP是肠道神经系统主要的抑制性递质。VIP是广泛存在的脑肠肽，在消化系统中十二指肠和结肠含量最高[13]，能松弛肠道平滑肌，抑制胃肠的运动[12]。VIP与结肠的节段非推进性运动有关，参与调节肠道动力及肠黏膜的机械化学免疫屏障[14]。VIP作为一种多效性作用的神经递质，具有扩张血管、降低血压的特点[15]，对消化道平滑肌的收缩产生抑制作用[16]。VIP浓度降低，可能引起结肠出现过度的节段性蠕动，使有效推动运动减弱。由于VIP浓度异常改变，使肠道正常运动生化功能的完整性被破坏，肠道运动功能失调，从而引起便秘[5]。

结肠的运动形式比较复杂，结肠的节段性运动使肠内容物得到混合搅拌，推进性运动将肠内容物从一个结肠段推送到相邻的远端结肠。陶春虹[16]研究表明，枳实能明显提高慢传输型便秘肠神经递质SP和VIP含量，促进肠运动。实验便秘模型组SP、VIP含量明显低于空白对照组(P＜0.01)，便秘模型小鼠肠道SP含量降低提示便秘小鼠的肠道收缩功能减弱，这可能是导致结肠动力减弱而发生便秘的原因之一，便秘模型小鼠肠道VIP含量降低提示VIP 表达降低使结肠阶段性蠕动增强，导致有效推动性运动减弱，从而引起大便排出困难。

AE对模型小鼠肌间神经丛SP、VIP含量增加有明显的促进作用，表明大黄素的促肠道动力作用与结肠SP、VIP分布增加存在着密切关系，可能与本组方有促进肠神经丛结构和功能恢复有关，其作用机制尚需进一步深入研究。大黄素是否对结肠其他胃肠激素、酶类及神经递质也产生影响，还需作更深入的研究。本研究结果为大黄素的临床应用提供了一定的实验依据。