消癌解毒方对结直肠癌细胞增殖的抑制作用及其机制研究

谭佳妮 ， 刘文豪 ， 沈卫星 ， 程海波

（1.南京中医药大学转化医学研究中心，国家中医药管理局名医验方评价与转化重点实验室，江苏省抗肿瘤验方与产业化工程实验室，江苏南京 210023；2.江苏省中医药防治肿瘤协同创新中心，江苏南京 210023）

结直肠癌是常见的恶性消化道肿瘤之一，其发病率在全球男性和女性恶性肿瘤类型中分别列第2位和第3位[1]，死亡率居第2位[2]，结直肠癌晚期重要脏器转移是其主要的死亡原因。在我国，结直肠癌的发病率及死亡率逐年上升，其发病速度为世界平均速度的2倍[3-4]。中医药在结直肠的预防与治疗中扮演着越来越重要的角色，从中医药中发掘有效的预防结直肠癌的靶点及药物已是近年的研究重点。消癌解毒方是国医大师周仲瑛教授结合多年的临床实践形成的临床有效验方，该方由白花蛇舌草、半枝莲、山慈菇、莪术、太子参、麦冬等组成，具有清热散结、消癌解毒，化痰祛瘀、益气养阴、扶正抗癌的功效。既往关于消癌解毒方的临床与实验研究发现，其对胃癌、食管癌、结直肠癌等多种消化道肿瘤具有确切疗效，可以提高患者抗肿瘤的免疫功能，与西医常规恶性肿瘤治疗方案比较，联合用药在改善中晚期恶性肿瘤患者生命质量与缓解中医症状方面具有明显的效果[5-7]。本研究在前期临床效应基础上，体外观察了消癌解毒方含药血清抑制结直肠癌细胞增殖的作用，从细胞周期改变的角度探讨其作用机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞及培养 人结直肠癌HT-29、HCT-116、LoVo细胞株均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。人结直肠癌HT-29、HCT-116、LoVo细胞株用RPMI 1640完全培养基（含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素及100 U/mL链霉素）于37℃5%CO2的培养箱中常规培养，取对数生长期的细胞用于后续实验。

1.2 药物及制备 消癌解毒方组成中药材均购自亳州国苑中药材饮片有限公司，经南京中医药大学邹立思教授鉴定为道地药材。于南京中医药大学药理教研室煎制：称取复方中各药材后，加入10倍药量的水，煎煮2次（分别为2、1.5 h），收集、合并2次滤液，减压浓缩至适当体积，最终成2 g/mL浓度的滤液，于4℃保存备用。

1.3 试剂与仪器 CyclinA2、CyclinB1、CDK1、P21、P27、Notch1、Hes1等抗体（美国Abcam公司）；ECL检测试剂盒（美国Thermo公司）。FACSCantoTM流式细胞仪（美国BD公司）；荧光倒置显微镜（日本Nikon公司）；ProwerPacTMBasic凝胶电泳仪（美国Bio-Rad公司）；Tanon-5500化学发光凝胶成像仪（天能科技有限公司）。

1.4 实验动物及含药血清制备 清洁级雄性新西兰兔2.0～2.2 kg，购于南京市江宁区青龙山动物繁殖场。动物质量合格证号：SCXK（苏）2012-0008。将兔随机分为对照组、给药组，每组2只。给药组给予消癌解毒方煎液灌胃，剂量为40 g/kg（为临床给药剂量的5倍），每日分2次灌服；对照组给予灌服等体积生理盐水。2组均连续灌胃5 d，末次给药前12 h禁食不禁水。给药2 h后，异氟烷麻醉，颈总动脉取血。室温静置30 min后以3 000 r/min离心5 min分离血清，合并同组血清，56℃灭活30 min，0.22μmol/L微孔滤膜除菌，放置于-80℃冰箱中保存备用。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 细胞增殖检测 取对数生长期结直肠癌细胞，调整细胞密度为104个/mL加入96孔板中，100μL/孔，置于体积分数5%CO2孵箱中。24 h弃掉培养上清后，加入体积分数5%、10%、15%的消癌解毒方含药血清100μL/孔。设6个复孔，继续培养48 h。干预结束后，每孔加入10μL细胞计数试剂盒8（CCK-8）溶液继续培养4 h，酶标仪检测450 nm处的吸光度（OD，D）值。根据D值计算各含药血清对细胞增殖的抑制作用。

1.5.2 细胞形态观察 对数生长期结直肠癌细胞贴壁后培养至细胞融合80%～90%时，分别加入5%、10%、15%消癌解毒方含药血清，孵育48 h后，倒置显微镜下观察细胞形态的变化。

1.5.3 细胞周期检测 取对数生长期结直肠癌细胞，调整细胞密度为104个/mL加入96孔板中，1 mL/孔，置于37℃体积分数5%CO2孵箱中。24 h后弃掉培养上清，加入体积分数5%、10%、15%的消癌解毒方含药血清2 mL/孔。设3个复孔，继续培养48 h。给药结束后，胰酶消化收集细胞并计数，加入1 mL预冷的体积分数70%乙醇中4℃固定过夜，以1 000 r/min离心5 min后用1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）重悬，离心弃上清后加入500μL染色液[25μL碘化丙啶（PI）染色液+10μL RNase]37℃避光孵育30 min，应用流式细胞仪检测细胞周期分布情况，用Kaluza Analysis软件进行细胞DNA含量及光散射分析。

1.5.4 细胞周期相关蛋白CyclinA2、CyclinB1、CDK1、P21、P27及Notch1/Hes1信号途径相关蛋白Notch1、Hes1表达的检测 采用蛋白免疫印迹（Western Blot）法。对数生长期结直肠癌细胞贴壁后培养至细胞融合80%～90%时，分别加入5%、10%、15%消癌解毒方含药血清，孵育48 h后，收集空白组细胞及处理后的细胞，用Western及IP裂解液裂解细胞提取蛋白。用BCA法定量蛋白，调整蛋白浓度后置于95℃金属浴中变性10 min。10%～12%分离胶和5%浓缩胶十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白。湿转转膜将蛋白转至PVDF膜上，100 g/L脱脂牛奶37 ℃封闭2 h。一抗（CyclinA2，1∶2 000； CyclinB1，1∶2 000；CDK1，1∶2 000；P21，1∶2 000；P27，1∶1 000；Notch1，1∶1 000；Hes1，1∶1 000）4 ℃孵育过夜。次日，PBST洗膜3次后，室温孵育二抗1 h，最后应用增强型化学发光（ECL）试剂进行显色，应用GelAnalysis软件进行条带分析。

1.6 统计方法 应用SPSS 21.0统计软件进行数据处理，实验数据以均数±标准差(-x±s)表示，采用单因素方差分析和t检验比较各组差异。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 消癌解毒方含药血清对结直肠癌细胞增殖的影响 表1关于CCK-8实验的结果显示，消癌解毒方含药血清处理人结肠癌HT-29、HCT-116、LoVo细胞48 h后，HT-29、HCT-116及LoVo细胞的存活率均有不同程度的降低，且该抑制作用随着含药血清浓度的增大而增强。15%含药血清对HT-29、HCT-116及LoVo细胞增殖的抑制作用分别为（37.64±1.62）%、（58.69±2.68）%及（38.54±2.95）%。可见，HCT-116细胞对含药血清最敏感。因此，我们选择HCT-116细胞为研究对象，进行下一步的实验研究。

2.2 消癌解毒方含药血清对结直肠癌细胞形态的影响 倒置光学显微镜下观察给予含药血清后HCT-116细胞形态的变化，结果如图1所示：正常HCT-116细胞呈梭形，细胞伸展，呈密集型或重叠生长；给予含药血清后，细胞呈现出不规则的形状、核裂碎、胞膜皱缩、间距变大。随着含药血清浓度的增加，细胞形态改变的情况越明显。

表1 消癌解毒方含药血清对结直肠癌细胞增殖的影响Table 1 The effect of CTR-containing serum on the proliferation of colorectal cancer cells （-x±s，n=6）

2.3 消癌解毒方含药血清对结直肠癌细胞周期的影响 PI可以与细胞内的DNA及RNA结合，通过流式细胞技术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度即可反应细胞内DNA含量。细胞周期的各个时期DNA含量是不同的，因此通过PI染色法对细胞内的DNA进行检测就可以将细胞周期的各时相区分开来。给予含药血清处理后，HCT-116细胞周期分布情况如图2、表2所示：与空白对照组比较，G2/M期细胞数随含药血清浓度增加而增加（P＜0.01），S和G0/G1期细胞数减少，S期尤其明显（P＜0.05或P＜0.01）。提示消癌解毒方含药血清能剂量相关性地诱导HCT-116细胞发生G2/M期阻滞。

图1 消癌解毒方含药血清对结直肠癌HCT-116细胞形态的影响（×200）Figure 1 The effect of CTR-containing serum on the morphological features of HCT-116 colorectal cancer cells（×200）

2.4 消癌解毒方含药血清对结直肠癌细胞周期相关蛋白表达及Notch1信号通路的影响 采用Western Blot法检测消癌解毒方含药血清对G2/M期周期相关蛋白以及周期依赖性蛋白激酶抑制剂表达的影响，结果如图3、表3所示，消癌解毒方含药血清能明显下调CDK1、CyclinA2、CyclinB1等促进细胞周期的蛋白并上调P21、P27等抑制周期进程的蛋白。同时，我们检测了给予含药血清后的HCT-116细胞内Notch1信号通路蛋白水平的变化，结果如图3、表3所示，随含药血清剂量的增加，Notch1及Hes1蛋白表达逐渐减少。提示消癌解毒方含药血清可能通过抑制Notch1/Hes1通路抑制周期相关性蛋白的表达而发挥调节细胞周期的作用。

图2 消癌解毒方含药血清对结直肠癌HCT-116细胞周期分布的影响Figure 2 The effect of CTR-containing serum on the cell cycle distribution of HCT-116 colorectal cancer cells

表2 消癌解毒方含药血清对结直肠癌HCT-116细胞周期分布的影响Table 2 The effect of CTR-containing serum on the cell cycle distribution of HCT-116 colorectal cancer cells （-x±s，n=3）

3 讨论

中医学认为，结直肠癌（大肠癌）是在脾气亏虚的基础上，因外感湿邪、饮食不节、情志失调等内外多种因素的诱导而生成癌毒，与湿、热、瘀等病理因素交杂复合，搏结于肠道，伤及肠腑，形成癌肿，导致肠腑通降失司的病变。因此，结直肠癌的基本病机是湿热瘀毒、脾气亏虚。消癌解毒方是国医大师周仲瑛教授结合多年的临床实践形成的有效验方。方中：白花蛇舌草、半枝莲为君药，清热散结、消癌解毒；山慈菇、莪术为臣药，化痰祛瘀、消肿散结；太子参、麦冬为佐使，益气养阴、扶正抗癌。我们的前期实验研究发现：在体内，消癌解毒方通过诱导肿瘤细胞凋亡显著抑结直肠癌CT-26细胞荷瘤小鼠肿瘤的增殖[8-9]；在体外，消癌解毒方含药血清抑制结肠癌细胞糖酵解过程抑制肿瘤细胞增殖[10]，但尚缺乏相关机制的深入研究。本研究发现，随着消癌解毒方含药血清浓度的增加，HCT-116细胞增殖活性显著下降。流式细胞仪结果显示，消癌解毒方含药血清增加了HCT-116细胞G2/M期比例，降低了G0/G1及S期细胞比例，使结直肠细胞HCT-116阻滞于G2/M期。表明消癌解毒方抑制HCT-116细胞增殖的机制可能与其调控细胞周期有关。

图3 消癌解毒方含药血清对细胞周期蛋白及Notch1通路相关蛋白表达的影响Figure 3 The effect of CTR-containing serum on the expression of cell cycle related proteins and Notch1 pathway related proteins

Notch1在结直肠癌组织中高表达，在结直肠癌形成过程中具有致癌基因作用[11]，且在肿瘤组织中的高表达与化疗耐药及肿瘤的侵袭转移有关[12-13]。Notch1信号分子对细胞的分化、增殖和凋亡有广泛的调控作用。Edelmann等报道，Notch1转录调节参与慢性淋巴细胞白血病细胞周期调控[14]。此外，在肝癌等的进展过程中，Notch信号通路还参与了肝癌细胞周期的调控[15]。本实验应用Western Blot检测了周期相关蛋白及Notch1通路相关蛋白表达的变化，结果显示消癌解毒方含药血清通过抑制Notch1/Hes1信号通路，增加了HCT-116细胞G2/M期比例，使结直肠细胞阻滞于G2/M期从而发挥其抑制肿瘤细胞增殖的作用，进一步明确了消癌解毒方抑制结直肠癌细胞增殖的作用机制。本研究可为消癌解毒方的临床开发与应用奠定理论和实践基础。

表3 消癌解毒方含药血清对细胞周期蛋白及Notch1通路相关蛋白相对表达的影响Table 3 The effect of CTR-containing serum on the relative expression of cell cycle related proteins and Notch1 pathway related proteins （-x±s，n=3，p）