基于代谢组学分析缺血性中风痰湿证生物标志物特点研究

荣立洋， 李毓秋

（1.三亚市中医院，海南三亚 572000；2.山东中医药大学，山东济南 250355）

缺血性中风（ischemic stroke，IS）是临床常见病，不仅具有高发病率的特点，同时还伴随着高死亡率、高致残率和高复发率的临床特点，已成为当今医学界的热门话题和研究热点。而随着人们生活水平的提高、饮食习惯的不规律和作息时间的紊乱等，脑血管病的发病率逐年增高，尤其是饮食不节，恣食肥甘厚味，导致越来越多的IS患者表现为明显的腹部肥胖、舌苔白腻、脉象弦滑等痰湿征象。代谢组学作为疾病研究的新方向，其核心的系统研究方法在理论上与中医理论极为相似[1]，就是利用代谢过程的终端来逆向分析生物机体的生理病理变化，以了解各种干预因素对个体产生的代谢影响，最终获得疾病和“证”的特征性代谢物，从而揭示中医“证”的本质。利用代谢组学分析IS痰湿证生物标志物特点有利于IS疾病的中医诊断，对中医辨证有更加科学的解释，以及对临床应用中药、针灸等中医方法治疗有借鉴意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2015年8月～2016年10月在山东中医药大学附属医院脑病科住院治疗的明确诊断为IS、中医证型为痰湿证的13例患者作为病例组（IS痰湿证组），另选取18例体检正常、中医体质为平和质的山东中医药大学及附属医院教职工作为正常对照组（平和质组）。IS痰湿证组的平均年龄为（60.35±9.58）岁，平和质组为（49.27±11.74）岁，2组的年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准 缺血性脑卒中的诊断参考2010年中华医学会神经病学分会脑血管病学组制定的《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010》[2]：注意发病形式、发病时间，排除脑外伤、中毒、癫痫后状态、瘤性卒中、高血压脑病、血糖异常、脑炎及躯体重要脏器功能严重障碍等引起的脑部病变，进行必要的实验室检查；除非特殊原因不能检查，所有疑为脑卒中者都应尽快进行脑部的影像学（CT或MRI）检查，排除出血性脑卒中，以确立缺血性脑卒中的诊断。

1.2.2 中医诊断标准 （1）中风病的诊断标准参照1996年由国家中医药管理局脑病急症协作组公布的《中风病诊断与疗效评价标准》[3]。主症：半身不遂，神识昏蒙，言语蹇涩或不语，偏身感觉异常，口舌歪斜；次症：头痛，眩晕，瞳神变化，饮水发呛，目偏不瞬，共济失调；起病方式：急性起病，发病前多有诱因，且常有先兆症状；发病年龄：多在40岁以上。（2）痰湿证的辨证标准参照《中医证候辨治规范》[4]、《中医内、外、妇、儿科病症诊断疗效标准（试行）》[5]、《中医诊疗常规》[6]拟定：满足肥胖、头闷痛、头重、口黏腻、渴不欲饮、咳痰或喉中痰鸣、纳呆、便溏、胖大舌或齿痕舌、苔厚腻、脉滑中的3项及以上者。

1.3 纳入标准 ①符合上述中西医诊断标准；②中医证型为痰湿证；③急性起病，且发病时间在72 h以内；④患者本人或家属知情并同意参加本研究者。

1.4 排除标准 ①不符合上述诊断标准或发病超过72 h的患者；②复发性中风患者；③经脑部CT或MRI检查确诊为脑出血或有继发性改变的患者（如缺血合并出血中风者）；④患者本人或家属不同意参加本研究者。

1.5 样本采集及处理

1.5.1 样本采集 纳入样本时严格按照纳入标准执行，所有受试者（IS患者入院当天），禁食8～12 h后，于清晨静息30 min后抽取空腹静脉血，离心后分离血清，置-80℃冰箱保存。

1.5.2 血清样本处理 在进行核磁共振测试前，将冻存的血液在室温下复苏，血清样品各吸取上清400μL，样品于1.5 mL离心管中；先后加入30μL含 0.05%2，2，3，3-三甲基甲硅烷基丙酸钠（TSP）的重水配制的磷酸缓冲液（K2HPO4/NaH2PO4，1.5 mol/L，pH=7.4）和170μL 重水1 min混匀。在4℃，12 000 r/min条件下离心10 min，取500μL上清液置于直径5 mm的核磁共振管。

1.6 血清生物代谢产物检测 实验检测设备为Varian Inova 600M Agilent。血清核共振谱图积分间距0.2× 10-4，积分区间0.5× 10-6～9.0× 10-6，去掉一段4.75×10-6～4.90×10-6（包含残余的水峰及其影响的区域）。使用处理软件（Mest Re Nova V9.0.1）对谱图进行傅立叶变换，完成基线校正、相位调整及定标等。为提高信噪比，所有谱图进行傅立叶变换时乘以增宽因子为1 Hz的指数窗函数。

1.7 主成分分析（PCA） 运用SIMCA软件（V14.1，MKS Data Analytics Solutions，Umea，Sweden），使用中心化（CTR）加对数（LOG）转换对数据进行格式化处理，随后开始自动建模分析。

1.8 正交偏最小二乘法—判别分析（OPLS-DA） 利用7折交叉验证（7-fold cross validation）对使用SIMCA软件分析OPLS-DA建模的结果进行质量验证，得到R2Y、Q2（模型对分类变量Y的可解释性和模型的可预测性），通过置换检验，进一步检验其有效性。

2 结果

2.1 生物代谢产物（PCA）分析结果 IS痰湿证组与平和质组的PCA得分散点图显示：2组样本区分显著，样本全部处于99%置信区间内。结果见图1。

2.2 生物代谢产物OPLS-DA分析结果 IS痰湿证组与平和质组的OPLS-DA得分散点图见图2，OPLS-DA载荷图见图3。图3横坐标表示化学位移的大小，从右到左，化学位移值越来越大；纵坐标表示经过回溯转换后载荷值的大小，其中颜色的深浅表示相关系数的大小，红色表示正相关，蓝色表示负相关。图中标记物质[肌酸（Cr）、柠檬酸（Cit）、内酯（Act）、乙酸（Ace）、亚麻酸（Ala）、甲酸（For）、1-甲基组氨酸（1-MH）]均为通过相关系数临界值检验的差异代谢物。

图1 IS痰湿证组与平和质组的PCA得分散点图Figure 1 Scatter diagram of PCA scores in IS patients with phlegm-dampness syndrome and healthy volunteers with balanced constitution

2.3 生物代谢产物OPLS-DA置换检验 IS痰湿证组与平和质组OPLS-DA模型的置换检验结果见图4。图4横坐标为置换保留度，原模型的R2和Q2值处于置换保留度等于1处的点，纵坐标为R2或Q2的取值，R2值（绿色圆点）与Q2（蓝色方点）构成的两条虚线为二者的回归线。原模型R2和Q2均接近1，说明建立模型不仅符合样本数据的真实情况，且如有新样本加入对原有分布情况影响不大，所以该模型可以充分解释2组样本之间的差异。

2.4 差异代谢物的筛选 通过分析OPLS-DA模型每种代谢物的相关系数，进一步总结具有统计学意义的代谢物。在相关系数图中，将每一个变量的loading值与其标准偏差相乘后进行数据的回溯转换，然后与相应的相关系数临界值表进行比对，可筛选出最终的组间差异代谢物。表1结果显示：IS痰湿证患者较健康人群血清中代谢物差异有统计学意义（P＜0.05）的有1-甲基组氨酸、醋酸、丙氨酸、丙酮、柠檬酸、肌酸、乙醇胺、甲酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异丁酸、异亮氨酸、乳酸、低密度脂蛋白、亮氨酸、脂质、赖氨酸、甲醇、蛋氨酸、肌醇、N-乙酰糖蛋白、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、极低密度脂蛋白、α-葡萄糖、β-葡萄糖。

图2 IS痰湿证组与平和质组的OPLS-DA得分散点图Figure 2 Scatter diagram of OPLS-DA scores in IS patients with phlegm-dampness syndrome and healthy volunteers with balanced constitution

图3 IS痰湿证组与平和质组的OPLS-DA载荷图Figure 3 OPLS-DA loading plots in IS patients with phlegm-dampness syndrome and healthy volunteers with balanced constitution

3 讨论

3.1 氨基酸代谢差异物 以上结果表明，30种代谢产物可能为IS痰湿证患者潜在的生物标志。分析结果发现，最终差异代谢产物大部分来自于氨基酸代谢，氨基酸不仅参与蛋白质合成，同时也参与嘧啶、嘌呤、卟啉等生物合成，所以氨基酸代谢也成为了代谢组学的研究重点。本研究中OPLS-DA相关系数绝对值越大，说明差异越明显。

图4 IS痰湿证组与平和质组OPLS-DA模型的置换检验结果Figure 4 Permutation test results for OPLS-DA model in IS patients with phlegm-dampness syndrome and healthy volunteers with balanced constitution

神经系统中有大量的游离氨基酸，如谷氨酸（Glu）、组氨酸（Gly）等[4]，尤其是脑脊液中，Glu含量最高。正常情况下，维持脑组织中游离氨基酸高浓度和血清间低浓度的浓度梯度差依赖于血脑屏障，当IS发生后破坏了血脑屏障，脑脊液含量增加，大量氨基酸也透过血脑屏障进入了外周血液[5]。Glu作为脑脊液中的重要物质，参与多种大脑认知与神经生理活动，正常情况下，由于血脑屏障的原因，Glu无法通过血液直接供给于脑，而是必须通过生物化学途径在脑内合成以完成脑内代谢，所以IS痰湿证患者Glu相关系数绝对值较大，差异度较高，可能与血脑屏障的破坏有直接关系。谷氨酰胺酶抑制剂6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸可减少Glu的释放，所以IS痰湿证患者谷氨酰胺（Gln）的含量异常很可能激活了中枢神经系统自我保护机制。除此之外，作为人体必须的氨基酸之一的赖氨酸（Lys），可以通过血脑屏障，帮助血脑屏障保持良好的通透性，促进脑组织的生长[6]，所以随着血脑屏障的破坏，IS痰湿证患者脑脊液中Lys含量与外周血中含量比会发生明显异常。

当IS发生时，脑组织会出现缺血缺氧、生化功能异常、血流量受限、葡萄糖供应不足等情况，同时糖酵解产生的葡萄糖-6-磷酸下降加剧了三羧酸循环无氧糖酵解反应[7]。有研究[8]表明，脑梗死大鼠血浆中葡萄糖-6-磷酸、核糖含量减少，而柠檬酸含量增多，因此，在减少氧气水平的情况下，糖酵解的增加和氧化柠檬酸循环通量的减少也可能是IS痰湿证患者氨基酸代谢异常的原因之一。同时，在叶酸代谢通路中，叶酸氧化过程需要甲酸通过叶酸结合四氢叶酸、甲酰四氢叶酸合成酶，介导形成10-甲酰四氢叶酸形式。除此之外，丝氨酸四氢叶酸也可合成甘氨酸，所以脑缺血后血清中会出现甲酸升高、叶酸减少、甘氨酸减少的情况[9]。因此，本试验中IS痰湿证患者甲酸与甘氨酸代谢物差异可能与叶酸代谢通路密切相关。

表1 2组间差异代谢物及OPLS-DA相关系数Table 1 Differential metabolites and OPLS-DA correlation coefficients in the two groups

3.2 能量代谢差异物 当脑区严重缺血，神经元死亡、糖代谢下降相继出现，因此，能量代谢障碍成为脑损伤的根本原因。而在未严重缺血的脑区则发生糖代谢率增加，葡萄糖无氧酵解增加，乳酸增多导致轻微酸中毒以形成局限性缺血保护作用。乳酸、肌酸含量异常均出现在脑中风发作后，尤其是乳酸的升高被认为是早期缺血的敏感指标[10]。IS痰湿证患者中存在α-葡萄糖、β-葡萄糖、乳酸、肌酸代谢差异，说明能量代谢发生明显异常。与此同时，在IS痰湿证患者与平和质的对比试验中发现存在丙酮代谢物差异，丙酮为脂肪酸氧化的中间产物，脂肪酸β氧化也是脑组织除葡萄糖无氧酵解途径外的重要能量代谢。三羧酸循环是机体获取能量的主要方式，是线粒体内进行的连续反应，其中亮氨酸和部分异亮氨酸可以转换成乙酰辅酶A，进入三羧酸循环以提供能量[11-12]。

3.3 脂类代谢差异物 由本研究结果可知，IS痰湿证患者存在脂质-CH2-C=O、脂质-CH2-CH=CH-、脂质=CH-CH2-CH-、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白代谢物差异。已知脂类代谢与动脉粥样硬化和缺血性心脑血管疾病关系十分密切，除此之外，痰湿证也与脂类代谢密不可分。笔者前期做过的相关统计结果表明，在亚健康人群中，痰湿质人群的血脂异常率约为90.2%。胆碱作为可以促进脑发育和提高记忆能力的重要物质，在促进脂蛋白构成、调节脂肪代谢、降低血清胆固醇等方面起着重要的作用。乙醇胺常存在于磷脂中，与胆碱共存，本试验验证了在IS痰湿证患者中乙醇胺存在代谢物差异，说明脂类代谢异常影响IS痰湿证的发生发展。

3.4 总结 综上所述，IS痰湿证患者血清代谢差异物主要涉及氨基酸代谢、能量代谢、脂类代谢，其中与血脑屏障破坏、脑神经自我保护机制、糖代谢、三羧酸循环、脂肪酸β氧化等环节密切相关。我国代谢组学研究起步较晚，尤其在IS疾病研究方面存在大量空白，IS疾病的发生发展也涉及众多环节，因此，在今后的研究中不能局限于单一因素、单一环节、单一通路，要建立多系统、多环节的复杂网络模式，以提高脑梗死的防治水平，以便更好地控制和预防IS疾病的发生。