辣椒籽抗菌肽提取条件优化及分离纯化

韩玉竹，李平兰，何 琴，赵展展，刘雪文，杨叶梅,3,*

（1.莫南大学动物科学学院，重庆 402460；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京 100083；3.重庆市畜牧科学院，重庆 402460）

抗菌肽是生物体自身产生的防御病原体入侵的小分子肽（通常分子质量小于10 kDa），是生物体先天免疫重要组成部分，可拮抗细菌、病毒、原生动物、丝状真菌和酵母等[1-2]。植物和其他生物组织一样，也会连续不断地受到致病微生物的威胁，在致病微生物和自身的协同进化下，推动了植物自身防御机制的形成[3-4]。其中植物种子因含有丰富的营养物质，更容易协同进化产生抗菌类物质，抗菌肽就是其中的一类[5]。由于抗菌肽自身的蛋白质特性、无污染性、发全性及抗菌特性，其在食品防腐保鲜、防腐剂替代研究和畜牧养殖业中作为饲料添加剂的应用研究具有优势，其科研和应用潜力引起国内外相关科学研究者和企业研发部的广泛关注。

辣椒（Capsicum annuum L.）作为一种常用的调味品，在世界广泛栽培。我国辣椒的种植面积约占所有蔬菜面积的10%，年产量高达2 800万 t。但占其干果质量30%～60%的辣椒籽，在加工过程中却未被充分利用，造成资源浪费[6]。据报道，辣椒籽中主要含膳食纤维、蛋白质和脂肪，其中蛋白质占其质量分数的17.30%左右，包含9 种必须氨基酸[7-8]。但是，我国辣椒种子蛋白的加工利用还有待开发。

近年来，网络技术发展也非常的迅速，而在智能电网中的继电保护装置，其实本质上也是一个计算机装置，作用就是对系统进行全面的监控工作，对整个网络的运行进行指导，让智能电网的系统运行能够高效和安全。同时，继电保护装置在对电力信息的数据和故障信息进行获取的时候，会及时反馈信息到系统的网络控制中心。另外，随着我国智能电网的发展越来越迅速，在自动化程度方面，电力系统也做得越来越好，这样就能够保障了电力系统的安全和高效。

实验室前期开展植物源抗菌肽筛选时，发现辣椒籽抗菌肽具有广谱抑制真菌的效果，尤其对谷类产品常见腐败菌黄曲霉具有强烈的抑制作用。本研究在此基础上优化了辣椒籽抗菌肽的提取条件，并结合超滤离心、葡聚糖凝胶层析等步骤，以期得到纯度较高的目标产物，为辣椒籽以及植物源抗菌肽的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

辣椒籽品种分别为天鹰小椒、石竹红、新化、子弹头、印度椒和贵州灯笼椒，购于重庆市牧荣农产品销售有限公司。

供试菌株：前期从玉米中分离筛选获得的黄曲霉（Aspergillus flavus）为莫南大学动物科学学院微生物学实验室保藏菌种。

1.2 仪器与设备

BSY-200T直立式多功能粉碎机 永康市铂欧五金制品有限公司；MYP11-2恒温磁力搅拌器 上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；EL104电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；2RH-250恒温培养箱 中国雪柜实业有限公司；IKA漩涡振荡器 广州仪科实验室技术有限公司；高速离心机 艾本德中国有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；冷冻干燥器 上海兰仪实业有限公司；凝胶层析柱、DHL-1恒流泵、自动部分回集器 上海青浦泸莫仪器厂；垂直板电泳仪 北京百晶生物技术有限公司；凝胶成像分析系统 上海勤翔科学仪器有限公司。

1.3 方法

2.2.4 硫酸铵饱和度对辣椒籽抗菌肽抑菌活性的影响

1.3.4 响应面优化

1.3.2 抑菌活性的测定

夏津县北城水系生态水土保持工程的实施，使项目区的林木覆盖率提高到15%，沙化和荒漠化情况得到了显著改善，田园小气候得到较大改善，农副产品商品率提高，经济效益和生态效益、社会效益收益显著，为沙化、荒漠化防治提供了成功经验。

以黄曲霉为指示菌，采用牛津杯平板扩散法测定辣椒籽蛋白提取物的抑菌活性[9]。将黄曲霉在PDA斜面上活化，待孢子长成后加入灭菌水，制成浓度为106个/mL的孢子悬浮液。移取1 mL孢子悬浮液到培养皿（直径90 mm）中，倒入冷却至45 ℃的PDA培养基20 mL，摇匀制备含菌平板。在含菌平板上放置灭菌的牛津杯，每个牛津杯里加入150 μL无菌蛋白提取液，28 ℃培养48 h后，测量抑菌圈直径。

1.3.3 辣椒籽抗菌肽提取条件优化

1.3.3.1 浸提液的选择

参考植物种子抗菌肽提取的相关文献，选用5 种浸提液：去离子水[10]、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS，0.02 mol/L，pH 7.4）、EDTA缓冲液（10 mmol/L Na2HPO4，15 mmol/L NaH2PO4，100 mmol/L KCl，1.5% EDTA，pH 5.4）[11-13]、Tris-HCl缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6）[14-15]、75%乙醇溶液。其他提取条件分别为：料液比1∶5（g/mL），4 ℃浸提12 h，硫酸铵饱和度70%。

1.3.3.2 料液比的选择

分别选用1∶3、1∶5、1∶7、1∶9（g/mL）的料液比，在EDTA缓冲液中添加脱脂辣椒籽粉，4 ℃放置过夜后，饱和度70%硫酸铵沉淀，比较料液比对抗菌肽提取的影响。

1.3.3.3 浸提时间的选择

6 种辣椒籽品种（天鹰小椒、石竹花、新化、子弹头、印度椒和灯笼椒）的蛋白提取物均对黄曲霉生长具有抑制作用（表3）。不同品种辣椒籽的抑菌活性有差异，其中贵州灯笼椒和印度椒所含抗菌肽的抑菌效果显著高于其他4 个品种。结合辣椒籽的获取及经济成本，选择灯笼椒辣椒籽作为研究材料，进行后续研究。

1.3.3.4 硫酸铵最佳饱和度的确定

参加捐款的干部职工纷纷表示，灾区群众不会孤独，水利系统的干部职工永远与灾区人民心连心，继续为受灾地区群众提供更多的支持和帮助。

结合上述最佳条件，对过滤后的辣椒籽浸提液分别加入不同饱和度（40%、50%、60%、70%、80%、90%）的硫酸铵，测定沉淀产物等量溶液复溶后的抑菌圈直径，以确定硫酸铵沉淀最适饱和度。

10 g辣椒籽粉碎后，用无水乙醚浸提过夜，去除粗脂肪。按料液比1∶5（g/mL）添加至乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）缓冲液中，4 ℃条件下浸提过夜。将浸出溶液用8 层纱布过滤，8 000 r/min离心15 min，取上清液按70%饱和度计量所需的固体硫酸铵量，研磨粉碎后缓慢加入，均匀搅拌至充分溶解，4 ℃静止4 h，10 000 r/min离心15 min，沉淀用等体积（10 mL）去离子水复溶，过滤除菌，进行后续抑菌活性的检测。

2.2.2 料液比对辣椒籽抗菌肽抑菌活性的影响

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels used for central composite design

1.3.5 模型的验证

对于 A 井，FB＝8·4m，GH＝153·9m，所以AB＝0·4m。A井长兴组分层顶面为-5 140·4m，故气水外边界为-5 140.8m，选-5 140m；气水内边界为-5 132.4m，选-5 130m。

采用响应面法优化辣椒籽抗菌物质的提取工艺，并根据优化后的条件参数进行验证实验。

1.3.6.2 凝胶色谱层析

1.3.6 抗菌肽的分离纯化

1.3.6.1 抗菌肽脱盐及粗分离

人脱离不了社会团体而存在，犹如人类无法避开自然规律的限制，人是自然的产物同样也是社会的构成，人不可能脱离外在世界而独自存在。“每个人的自由发展是一切人自由发展的条件”[21]，反之只有在集体自由之中才能体验自我的自由。人若独立于社会集体之外，反而获得的是一种茫然失据的孤独与空虚。自由何为？人类的生存、自由与发展在集体中的共同交涉下才能够把握与实现，把外界屏蔽于自我之外的个体，只是将自由与自我割裂。社会文明给人类带来的是狭小的空间与拘束感，体育则是给予人类欢腾的场域与无束缚感。体育让人类在公共空间中集体释放天性、呈现自我。

对辣椒籽抗菌肽粗提物复溶后，1 kDa透析袋4 ℃透析24 h，期间换液3～4 次，除去小分子糖、盐等。将透析后的提取液加入10 kDa超滤管，5 000 r/min离心1 h，分别回集超滤管上面的截流液和下面的管底液，检测其抑菌活性，真空冷冻干燥保存备用。

1.1.4 结局指标 ①上消化道出血发生率；②病死率；③血钙浓度；④血磷浓度；⑤血镁浓度；⑥甲状旁腺激素（PTH）水平；⑦碱性磷酸酶（AKP）水平；⑧血肌酐水平；⑨肾小球滤过率。

新课标对课堂教学的要求就是教学活动的有效性和高效性，而创新思维的培养是实施高效课堂的根本。我们的任务首先就是培养学生的创新思维，努力提升学生的领悟水平。培养学生的创新意识和创新能力，就要培养学生敏锐的观察力、高效持久的记忆力、创造性的思维能力、操作能力、顽强的毅力、丰富的想象力等。我们要不断引导学生领悟问题，在常规方法行不通时，也有特殊方法让我们解决问题，培养意志品质和信心决心。课堂教学中教学方式和教学内容的革新，是当今教学改革的必需。教师要积极指导学生运用已有知识，运用已有能力去进行创造性思维活动，通过不断历练，达到学会学习的境地，为他们的思维发展插上飞翔的翅膀。

采用填料葡聚糖凝胶G-50进行凝胶层析，用去离子水对柱子进行平衡，直到检测洗脱液pH值恒定时为止。将超滤离心后回集到的抑菌效果好的目标产物配制成10 mg/mL溶液，滤膜（0.45 μm）过滤后按5 mL的加样体积进行上样。用去离子水洗脱样品，恒流泵设定恒速为20 r/min，50 min/管，每管约4 mL，洗脱时间为250 min。

将缓冲器轴向力减去阻尼力，获得气弹力和摩擦力；绘制“缓冲系统行程—气弹力和摩擦力”曲线，与静压曲线进行对比，根据两条曲线的差异情况确定起落架缓冲功能是否异常，如果异常，根据异常出现的起始点确认异常时的缓冲器行程，并记录起落架载荷。

1.3.6.3 样品回集

紫外检测波长为280 nm，逐管检测蛋白质含量，根据检测值，分别回集出现波峰时所对应的组分，冷冻干燥。用去离子水制备适当浓度进行抑菌实验，以确定目标样品。

1.3.6.4 Tricine-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，Tricine-SDS-PAGE）检测抗菌肽分子质量

表2 电泳胶配方Table 2 Compositions of separating and stacking gels

将通过Sephadex G-50色谱柱分离纯化获得的目标样品用去离子水复溶，配制合适的浓度。取20 μL目标样品与5 μL上样缓冲液混合，在水浴中煮沸5 min，然后置冰浴中快速冷却。根据表2的配方制备浓缩胶（15.5%）、夹层胶（10%）和分离胶（4%），3 种胶的制胶体积比为4∶1.5∶1。

取超低分子质量蛋白Marker 10 μL、待测样品20 μL分别上样，电泳时，先设定30 V电压，待样品进入分离胶上沿时，电压调至100 V，直至溴酚蓝距离胶底部1 cm左右时停止电泳，整个电泳时间大约需要4～5 h。电泳结束后，将凝胶浸入5%戊二醛固定液中固定20 min，然后用考马斯亮蓝G-250染色液摇床染色40～60 min，用蒸馏水洗涤凝胶，脱色液脱色后，凝胶成像仪照相保存。

1.4 数据的统计与分析

数据采用Excel处理并运用SPSS 20.0进行统计和分析。

2 结果与分析

2.1 不同品种辣椒籽蛋白提取物对黄曲霉的抑菌活性

将脱脂后的辣椒籽粉以1∶5（g/mL）的料液比与EDTA缓冲液混合后，于4 ℃分别浸提4、8、12、16、20、24 h，比较浸提时间对辣椒籽抗菌物质提取的影响。

表3 不同品种辣椒籽抗菌肽对黄曲霉的抑菌活性Table 3 Antifungal activities of antimicrobial peptides from seeds of different varieties of hot pepper against A. fl avus

2.2 抗菌肽提取条件的优化

2.2.1 缓冲液的选择对抗菌肽提取的影响

如图1所示，几种浸提液浸提后获得的抗菌肽均对黄曲霉生长具有抑制作用。其中EDTA缓冲液浸提后的抑菌圈直径显著大于其他几组（P＜0.05），因此后续试验选用EDTA缓冲液进行。

图1 不同缓冲液对抗菌肽抑菌活性的影响Fig. 1 Effect of different extraction buffers on the activity of antifungal peptides from hot pepper seeds

根据单因素试验结果，选取影响抗菌物质产量的3 个因素（料液比、浸提时间、硫酸铵饱和度）为自变量，抑菌圈直径为响应值，采用Box-Behnken设计方法，设置3因素3水平响应面试验，试验因素与水平见表1。

图2 料液比对抗菌肽抑菌活性的影响Fig. 2 Effect of solid-to-solvent ratio on the activity of antifungal peptides from hot pepper seeds

由图2可知，当料液比为1∶5（g/mL）时，提取物的抑菌圈直径显著大于其他几组（P＜0.05），效果最好，因此，后期响应面优化试验选用1∶5（g/mL）料液比作为中心试验点。

2.2.3 浸提时间对辣椒籽抗菌肽抑菌活性的影响

图3 浸提时间对抗菌肽抑菌活性的影响Fig. 3 Effects of extraction time on the activity of antifungal peptides from hot pepper seeds

如图3所示，随着浸提时间的延长，抗菌产物的得率增加，当浸提时间为16 h时，提取率最大，当浸提时间大于16 h，抑菌圈直径略有减小，但差异不显著（P＞0.05）。因此，确定抗菌肽最适浸提时间应控制在16 h左右，并选择其为下一步响应面试验的中心试验点。

1.3.1 辣椒籽蛋白提取物的制备

由图4可知，随着硫酸铵饱和度的升高，其沉淀所得物对黄曲霉菌的抑菌圈直径越大，但当硫酸铵饱和度达到80%时，沉淀出的抑菌产物与90%饱和度硫酸铵的抑菌效果无显著差异（P＞0.05），综合考虑得率和硫酸铵用量，选择80%饱和度的硫酸铵为后续响应面试验的中心试验点。

图4 硫酸铵饱和度对抗菌肽抑菌活性的影响Fig. 4 Effects of ammonium sulfate saturation on the activity of antifungal peptides from hot pepper seeds

2.3 辣椒籽抗菌肽提取条件的响应面优化

2.3.1 回归模型的建立

表4 中心组合试验设计及结果Table 4 Central composite design with experimental results

响应面试验设计和结果如表4所示，使用Design Expert 8.0.6软件对数据进行多元回归拟合，获得辣椒籽抗菌肽的抑菌圈直径（Y）对料液比（A）、浸提时间（B）、硫酸铵饱和度（C）的多项回归方程：

2.3.2 回归模型方差分析

将以上回归模型进行方差分析，结果如表5所示。模型回归极显著（P=0.001 0），失拟检验不显著（P=0.428 79），说明未知因素对试验结果干扰较小。另外，模型的决定系数R2为0.949 3，表明方程与实际的测试数据吻合良好，较好反映了抗菌肽抑菌圈直径与料液比、浸提时间、硫酸铵饱和度的关系，因此，该模型可用于分析和预测辣椒籽抗菌肽的提取条件。通过F检验确定回归方程中每个变量对响应值影响的显著性，模型一次项A、B、C不显著；二次项A2、B2、C2均处于极显著水平；交互项AB、AC、BC均不显著。

表5 拟合二次多项式模型的方差分析Table 5 Analysis of variance (ANOVA) for the fitted quadratic polynomial model

2.3.3 响应面分析

1.4 统计学分析 运用SPSS 21.0统计软件对数据进行统计学分析。计数资料以[例(%)]表示，数据比较采用χ2检验和描述性分析，P<0.05为差异有统计学意义。对差异有统计学意义的变量采用Logistic多因素进行逐步回归分析。重复测量的计量资料采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

根据回归方程制作的响应面立体分析图和等高线图如图5所示，分别反映了3 个因素（料液比、浸提时间、硫酸铵饱和度）两两交互作用对响应值的影响。从方程可以看出，二次项的系数都是负数，以它为特征的抛物面开口方下，具有极大值点。通过Design Expert 8.0.6.1软件分析，辣椒籽抗菌肽最佳提取条件为料液比1∶5.05（g/mL）、浸提时间16.13 h、硫酸铵饱和度81.15%，在此条件下抗菌肽的抑菌圈直径为23.77 mm。

图5 各因素对辣椒籽抗菌肽抑菌活性影响的响应面及等高线图Fig. 5 Response surface and contour plots showing the interactive effect of various factors on the activity of antifungal peptides from hot pepper seeds

2.3.4 回归模型的验证

为进一步验证预测值，将优化确定的提取条件进行验证，重复6 次，结果显示抗菌肽的抑菌圈直径平均值为23.89 mm，与预测值拟合率为99.49%，表明预测值和实际值吻合良好，优化模型可靠。优化后抗菌肽活性比优化前（12.34 mm）提高了93.60%，表明本实验所确定的优化方案的设计合理有效，获得的提取条件可以显著提高抗菌肽的得率。

2.4 抗菌肽的分离纯化

2.4.1 抗菌肽脱盐及粗分离

3）主控芯片发送AT+NSOST指令，BC95模组发送数据至云服务器，指令中需填入云服务器的IP地址、端口号、待发送的数据长度和数据。

目前，国家对于区域创新的体制较为成熟，建立了较为健全的机制，但是在区域创新能力比较优势的研究上较为薄弱，尚未有辽宁地区独特的指标体系。朱玉春、付辉辉利用专利授权量描述区域创新能力，以我国八区域划分理论为基础，通过1996年-2005年的相关数据分析认为我国区域创新能力差异呈扩大趋势。甄峰曾在2000年提出以知识创新能力和技术创新能力为基础和核心的评价体系，具体指标如表：

将辣椒籽抗菌肽用透析袋脱盐处理后，再使用10 kDa的超滤管超滤离心，使辣椒籽抗菌肽达到粗分离目的，分别检测小于10 kDa组分和大于10 kDa组分的抑菌效果，选择具有良好抑菌效果的组分（＜10 kDa）进行下一步分离纯化。

2.4.2 葡聚糖凝胶柱层析

将10 kDa超滤管超滤后抑菌效果好的组分用葡聚糖凝胶G-50柱层析，以实现分离纯化的目的。通过上样量5 mL；流速20 r/min；洗脱时间250 min，在波长280 nm测定吸光度。如图6所示，分别回集3 组分峰，以黄曲霉为指示菌，分别检测各组分的抑菌活性。结果显示组分3的抑菌效果最好，确定组分3为目标样品。因组分2和组分3的峰有少部分重叠，为保障目标样品的纯度，通过不回集与组分2重叠的回集管，并对目标抗菌肽样品进行二次柱层析纯化，冷冻干燥后进行后续分子特性检测。

图6 凝胶层析结果Fig. 6 Gel chromatography of antifungal peptides from hot pepper seeds

2.4.3 目标样品的分子质量测定

将葡聚糖凝胶柱-G50柱层析分离得到目标样品使用Tricine-SDS-PAGE检测其纯度和分子质量大小。如图7所示，抗菌肽只有一条清晰条带，说明纯化效果较好，通过和超低分子质量蛋白质Marker对比可估计其分子大小在7.8 kDa左右。

图7 Tricine-SDS-PAGE检测结果Fig. 7 Results of Tricine-SDS-PAGE

3 讨 论

发全、高效天然生物防腐剂的开发逐渐成为农产品防腐保鲜领域的研究热点[16-17]。植物抗菌肽是植物屏障防御系统的重要组成部分[18-19]。目前已从许多植物种类的种子、花、根和叶中分离出对农产品腐败菌、植物病原菌以及人类致病菌有活性的抗菌肽[20-24]。因此，植物抗菌肽被认为是具有重要应用前景的抗菌类化合物。

韩玉竹等[9]通过对解淀粉芽孢杆菌H15所产抗菌肽的提取条件进行优化，获得了比优化前高53.48%的优化条件。胡欣蕾等[25]以花脸香蘑菌丝体为原料，在单因素试验的基础上结合正交试验优化花脸香蘑菌丝体多糖提取条件，使花脸香蘑菌丝体多糖的提取率由最低的3%左右提高到15.79%。天然抗菌肽的提取方法目前有硫酸铵沉淀法、碱溶酸沉法和有机溶剂提取等。其中最常用于植物源抗菌肽的是硫酸铵沉淀法[8,26-27]，因为硫酸铵溶解性好，能形成高盐环境，有利于蛋白沉淀，同时在纯化过程中不会影响蛋白活性。然而，由于原料理化特性差异，提取工艺也不同。目前还鲜有辣椒籽抗菌肽提取工艺的报道。因此，本研究依据前人的工作基础，考察不同浸提液、料液比、浸提时间、硫酸铵饱和度对辣椒籽抗菌肽提取的影响。首先应用单因素试验，初步评价各因素对辣椒籽抗菌肽的提取效果，然后进一步在单因素试验基础上，通过响应面法对主要影响因素（料液比、浸提时间、硫酸铵饱和度）进行优化和评价，建立辣椒籽抗菌肽提取条件的二次多项式回归模型，并利用统计学方法对该模型进行显著性检验。通过对该模型进行求导和解矩阵可知，脱脂辣椒籽粉按料液比1∶5.05（g/mL）加入到EDTA缓冲液中浸提16.13 h后取上清液，添加81.15%饱和度的硫酸铵可以获得较大的得率，预测值为23.77 mm。在此条件下再进行验证实验，得到抗菌物质抑菌抑菌圈直径23.89 mm/150 µL，与预测值拟合率达99.49%，比优化前（12.34 mm）提高了93.60%。说明本研究所确定的优化方案的设计合理有效，获得的提取条件能够明显提高抗菌肽产量。

抗菌肽的分离纯化主要是基于原料的物理化学性质，通常包括超滤、凝胶过滤层析、离子交换层析等分离步骤。在实际操作中，为达初步或精确分离的目的，一般会选择2 种或更多种纯化方法[28]。姜太玲[29]将花椒籽抗菌肽经过10 kDa和5 kDa的超滤管进行分段分离后再选择抑菌效果最好的组分过葡聚糖凝胶柱层析，获得达到电泳纯的目的样品。王战勇等[30]发现使用葡聚糖凝胶-G50和葡聚糖凝胶G-25串联凝胶层析的效果明显比只使用葡聚糖凝胶G-50的效果好。本研究通过10 kDa超滤粗分离后，选择抑菌效果好的组分过葡聚糖凝胶G-50柱层析，纯化后的抗菌肽经Tricine-SDSPAGE检测已达到电泳纯，分子质量在7.8 kDa左右，说明辣椒籽蛋白提取物的主要抑菌成分为抗菌肽。研究结果可为后续辣椒籽抗菌肽基本特性研究及抗菌肽的产业化应用提供参考依据。

10.为加快浦东新区建设，提供开发、投资的必要基础设施，浦东新区新增财政收入，将用于新区的进一步开发。

（1）社会团体财产权。社会团体法人财产观认为行业协会商会、工会、宗教组织等社会团体应对合法所得享有财产权，政府或个人等投入社会团体的资源不应视为投资行为而享有任何财产权利。如贾西津（2016）认为“将行政支持误当成行政投资……易形成国有资产的不当扩大化”，建议采用“行业协会资产”这一政策性概念。沈永东、宋晓清（2016）提出，行业协会商会脱钩改革要确保行业协会商会真正拥有独立自主权，拥有独立的社团法人地位，政府不应干涉行业协会商会独立自主开展活动。