桑黄菌丝体与子实体成分的比较分析

叶玉洁，石 光，周正乙，王佳琪，发丽萍*，杜培革*

（北华大学药学院，吉林 吉林 132013）

桑黄（Phellinus igniarius）是针层孔菌属真菌火木层孔菌，是一种珍贵的多年生大型药用真菌，又名桑寄生、桑臣、桑耳、树鸡、胡孙眼、桑黄菰、桑黄菇等[1-2]。桑黄作为我国传统的应用型中药材之一，药用最早回载于李时珍《本草纲目》中，性甘、平、味苦、味辛，归肝、膀胱经[3]，是目前公认的抗癌效率较高的一种药用大型真菌，在医药领域具有重要的应用价值，有“森林黄金”之美称[4-6]。

传统上，桑黄的活性成分是从子实体中提取[7-8]，但受生理生态的特殊性和复杂性以及外部环境条件的制约，桑黄在自然界中形成子实体稀少，特别是形成可用子实体需要多年，人工栽培难度较大，资源匮乏[9-10]。因此，桑黄的开发和利用也受到限制，采用液体发酵技术培养桑黄菌丝体成为研究热点[11-12]。

本研究对桑黄液体发酵菌丝体和野生桑黄子实体的基本营养成分、氨基酸和微量元素的组成，以及多糖、黄酮类、三萜类物质含量进行对比分析和评价[13]，为桑黄作用的物质基础研究提供理论和实践依据，以期获得桑黄菌更重要的应用价值和更为广阔的开发前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑黄菌（菌株编号ACCC 52364）来自中国农业微生物菌种保藏管理中心，来源中国医学科学院药用植物研究所，由PDB培养液液体摇瓶发酵获取[14]。

野生桑黄子实体购自延吉百纳和商贸有限公司，经北华大学李凤丽教授鉴定为长白山野生桑黄子实体；结肠癌SW620细胞、肝癌HepG2细胞由北华大学生命科学中心提供。

PDA培养基 海博生物技术有限公司；PDB培养基、葡萄糖标准品（纯度≥98%） 北京索莱宝生物科技有限公司；芦丁标准品（纯度≥98%）、齐墩果酸标准品（纯度≥98%） 中国药品生物制品检定所；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

ThermoMixer C型恒温振荡器 德国Eppendorf公司；立式压力蒸汽灭菌器、恒温生化培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；UV-2550紫外-可见分光光度计 岛津国际贸易有限公司；Infinite M200酶标仪 瑞士Tecan公司；BenchTop Pro台式冷冻干燥机美国Virtis公司；全自动氨基酸分析仪、原子发射光谱仪北华大学分析测试中心；K1100F全自动凯氏定氮仪济南海能仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑黄菌丝体培养

菌种活化：将桑黄母种用接种环取出，接种于PDA固体培养基中活化，于28 ℃培养7 d，湿度适宜。用0.5 cm2活化后的斜面母种，再接种于100 mL PDB液体培养基中，培养5 d后即为菌种液。

液体摇瓶发酵培养：将菌种液接至PDB培养液中，接种量为10%，在250 mL烧瓶中装液100 mL，于28 ℃转速150 r/min摇床中培养10 d，抽滤，蒸馏水洗涤5 次，回集菌丝体，冷冻干燥。

1.3.2 水分测定

减重法测定水分含量[15]，分别取桑黄菌丝体、子实体约5 g，平铺于干燥至恒定质量的称量瓶中，精密称定；开启瓶盖于105 ℃干燥，移置干燥器中，放冷30 min，精密称定，重复上述操作直至恒定质量，根据减失的质量，计算含水量，平行测定3 组数据。

1.3.3 灰分测定

灼烧法测定灰分含量[16]，分别取桑黄菌丝体、子实体粉末约3 g，置炽灼至恒定质量的坩埚中，精密称定，500 ℃炽热至完全炭化并恒定质量，精密称定，根据残渣质量，计算总灰分含量，平行测定3 组数据。

1.3.4 粗蛋白测定

采用凯氏定氮法测定粗蛋白含量[17]，称取干燥至恒定质量的桑黄菌丝体、子实体粉末约2 g，置于消解管中，浓硫酸浸泡24 h后，消解仪150 ℃消煮3 h。加入双氧水若干，待溶液颜色变成无色透明或淡黄色，加热温度改为300 ℃，挥去黄烟后停止加热，冷却后置于全自动凯氏定氮仪中，平行测定3 组数据。

1.3.5 粗脂肪测定

采用索氏抽提法测定粗脂肪含量[18]，称取干燥至恒定质量的桑黄菌丝体、子实体粉末约5 g，精密称定，用滤纸包裹置于恒定质量抽提瓶中回流提取10 h。提取完成后，取出滤纸包，蒸馏得淡黄色的粗脂肪，烘干至恒定质量，计算粗脂肪含量，平行测定3 组数据。

1.3.6 粗纤维测定

采用酸性洗涤法测定粗纤维含量[19]，称取干燥至恒定质量的桑黄菌丝体、子实体粉末约5 g，精密称定，置于500 mL锥形瓶中，加入200 mL煮沸的体积分数为1.25%的硫酸，维持体积恒定回流30 min，抽滤，沸水洗涤至溶液呈中性，残留物用20 mL煮沸的质量分数为1.25%的氢氧化钠溶液回流30 min，抽滤，沸水洗涤至溶液呈中性，依次再用无水乙醇、乙醚洗涤2 次，移入干燥至恒定质量的坩埚中，于105 ℃烘干至恒定质量，计算粗纤维含量，平行测定3 组数据。

1.3.7 氨基酸、矿物元素成分分析

氨基酸和矿物元素分别采用氨基酸全自动分析仪[20]和微波消解ICP-AES法测定[21]。

1.3.8 粗多糖含量测定

采用苯酚-硫酸法测定多糖含量[22]，取桑黄菌丝体及子实体于50 ℃干燥至恒定质量，平行称取3 组，热水提取，提取温度80 ℃，提取时间4 h，料液比1∶40（V/V），提取次数3 次，合并滤液，减压浓缩，80%乙醇溶液醇析沉淀，以葡萄糖为标准品。

1.3.9 粗黄酮含量测定

取桑黄菌丝体及子实体于50 ℃干燥至恒定质量，平行称取3 组，60%乙醇溶液提取，提取温度90 ℃，提取时间4 h，料液比1∶30（V/V），然后过滤得桑黄醇提物。取适量醇提物溶于70%乙醇溶液，以芦丁为标准品，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法测定黄酮含量[23]。

1.3.10 粗三萜含量测定

以齐墩果酸为标准品，采用冰乙酸-香草醛测定三萜含量[24]。精密称定1.3.9节桑黄醇提物约1 g，平行称取3 组，置100 mL容量瓶中，加氯仿50 mL萃取6 h，萃取2 次，合并滤液，减压浓缩至干，用无水乙醇溶解。

1.3.11 主要功能成分活性比较

1.3.1 1.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率测定

通过DPPH自由基清除率比较3 种活性成分体外抗氧化活性[25]。取稀释到不同质量浓度的样品100 µL加入到96 孔板中，加入DPPH溶液100 µL，充分摇匀后避光处理，置于25 ℃恒温箱中静置30 min，于517 nm波长处测吸光度，比较活性最高成分。DPPH自由基清除率计算如式（1）所示：

式中：Ax为不同质量浓度样品+DPPH吸光度；Ay为不同质量浓度样品+蒸馏水吸光度；A0为蒸馏水+DPPH吸光度。

1.3.1 1.2 活性成分对肿瘤细胞的生长抑制作用

SW620细胞用含有10%胎牛血清（fatal bovine serun，FBS）的DMEM高糖培养基培养，HepG2细胞用含有10% FBS的RPMI-1640培养基培养，取其对数生长期细胞，用于后续实验。采用MTT法[26]检测DPPH自由基清除率最高成分对肿瘤细胞的生长抑制作用。细胞接种于96 孔板内（5×106个/孔），培养48 h，SW620和HepG2细胞分为对照组和多糖（50、100、200、500、1 000 mg/mL）组，对照组细胞加入培养液，其余各组细胞分别加入上述质量浓度桑黄多糖，培养24 h后加入MTT，4 h后弃去上清液，每孔加入150 µL二甲基亚砜，振荡10 min后，用酶标仪在490 nm波长处测量吸光度。细胞抑制率按式（2）计算：

式中：Ax为实验组吸光度；Ay为对照组吸光度；A0为空白对照组吸光度。

2 结果与分析

2.1 桑黄菌丝体培养

图1 桑黄菌丝体培养Fig. 1 Mycelial culture of P. igniarius

PDA固体培养基中可观察到桑黄菌丝体生长新区呈锯齿状（曲线所示），轻微升起的气生菌丝体延伸到生长区的边缘（箭头所示），菌落白色至微带奶油黄色、黄褐色、蜜黄色边缘绒毛状，反面无变化（图1A）；较老的部位为棉花状和羊毛状、毡状，反面奶油黄色至黄褐色（图1B）。PDB液体培养基中可观察到桑黄菌丝体呈菌丝球状态（图1C），菌丝形态特征一致，均为多分支，可见菌丝横隔，无锁状联合（图1D）。

2.2 主要营养成分含量比较分析

桑黄菌丝体和子实体主要营养成分含量比较如表1所示，菌丝体水分、灰分含量显著低于子实体（P＜0.05），粗纤维含量极显著低于子实体（P＜0.01），但粗脂肪和粗蛋白含量极显著高于子实体（P＜0.01），均具有统计学意义。

表1 桑黄菌丝体与子实体主要营养成分质量分数比较Table 1 Comparison of main nutrient contents in mycelium and fruit body of P. igniarius%

2.3 氨基酸含量分析

从表2可知，在所测定的17 种氨基酸中，桑黄菌丝体和子实体均含有人体必需的多种氨基酸，氨基酸种类齐全。桑黄菌丝体氨基酸总量为25.11%，子实体氨基酸总量为4.69%，桑黄菌丝体氨基酸总量高于子实体，且所检测出的17 种氨基酸含量均高于子实体，其中菌丝体中Glu含量最高，为2.86%；子实体中Met含量最高，为0.66%。所检出的7 种人体必需氨基酸Thr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Lys总量分别占菌丝体、子实体氨基酸总量的38.99%、46.70%。

2.4 矿物元素分析

采用ICP-AES法快速测定Li、Na、Mg、Al、P、K、Ca、Ti、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Sr、Mo、Cd、Sn、Ba、Hg、Pb共24 种元素，检出K、Ca、Na、Mg、Al、Zn、Fe、Cu、Mn、Ba、P、Cr、Sr共13 种元素，结果表明，菌丝体含K 98.440 0 mg/kg、Ca 239.281 0 mg/kg、Na 543.685 0 mg/kg、Mg 269.744 0 mg/kg、Al 2 2 4.4 2 7 0 m g/k g、Z n 2 1.6 1 5 0 m g/k g、F e 212.222 0 mg/kg、Cu 27.063 8 mg/kg、Mn 4.112 6 mg/kg、Ba 1.845 9 mg/kg、P 13 767.400 0 mg/kg、Cr 5.536 5 mg/kg、Sr 0.897 4 mg/kg；子实体含K 130.211 0 mg/kg、Ca 581.768 0 mg/kg、Na 57.718 8 mg/kg、Mg 349.221 0 mg/kg、Al 332.118 0 mg/kg、Zn 14.907 2 mg/kg、Fe 97.928 4 mg/kg、Cu 9.860 7 mg/kg、Mn 88.248 9 mg/kg、Ba 1.242 4 mg/kg、P 5 509.630 0 mg/kg、Cr 4.451 8 mg/kg、Sr 5.640 6 mg/kg，其中矿物元素含量比较分析如图2所示。

图2 桑黄菌丝体与子实体矿物元素比较Fig. 2 Comparison of contents of mineral elements in mycelium and fruit body of P. igniarius

2.5 主要功能成分比较分析

2.5.1 主要功能成分含量比较分析

表3 桑黄菌丝体与子实体主要功能成分质量分数比较Table 3 Comparison of contents of main functional components in mycelium and fruit body of P. igniarius%

从表3可以看出，桑黄子实体主要功能成分均高于菌丝体，其中桑黄多糖质量分数最高，为30.48%。

2.5.2 主要功能成分活性比较分析

图3 DPPH自由基清除体外抗氧化活性比较Fig. 3 Comparison of in vitro DPPH radical scavenging capacity of main functional components in mycelium and fruit body of P. igniarius

由图3可以看出，质量浓度在1.25 mg/mL时多糖达到最高清除率为77.14%，质量浓度在0.625 mg/mL时黄酮达到最高清除率为61.37%，质量浓度在1.25 mg/mL时三萜达到最高清除率为49.97%。

与对照组相比，不同质量浓度桑黄菌丝体、子实体多糖SW620和HepG2细胞抑制率比较差异具有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 各组SW620和HepG2细胞抑制率（n=6，x±s）Table 4 Inhibition rates of SW620 and HepG2 cells by polysaccharides from mycelium and fruit body of P. igniarius (n= 6, x± s)

3 结 论

桑黄菌丝体中水分、灰分、粗纤维含量显著或极显著低于子实体，但菌丝体中粗脂肪、粗蛋白含量极显著高于子实体（P＜0.01）；因为蛋白含量的显著差异，导致桑黄菌丝体和子实体氨基酸含量差异较大，但二者均含有17 种氨基酸，种类丰富，且菌丝体氨基酸总量为25.11%，高于子实体氨基酸总量，可提供人体必需多种氨基酸，维持机体免疫力。此外，两者均含有多种有益矿物元素，共检测出13 种微量元素，其中包含Al、Na、Mg、Ca、K、P六种人体必需常量元素，Fe、Zn、Cu、Mn、Cr、Se六种人体必需微量元素。多项研究报道桑黄菌丝体、子实体中均含有丰富的多糖、黄酮、三萜类物质，为桑黄主要活性成分[27]，具有抗氧化、抗肿瘤、降血压等功效[28-29]。利用DPPH自由基体外清除率测定比较桑黄子实体中3 种主要功能成分的活性，分析得出桑黄多糖抗氧化活性较好；进一步通过细胞增殖实验，对桑黄菌丝体、子实体多糖活性进行比较，结果表明与野生桑黄子实体相比，菌丝体功能成分活性较低，其中多糖成分活性较好，具有抗氧化、抗肿瘤细胞增殖等功效[30-34]。研究表明液体发酵所得桑黄菌丝体同样具有较高营养价值和开发价值，可为桑黄的进一步深入研究提供基本数据。