UPLC-MS/MS测定葡萄酒中29 种单体酚方法的建立

2020-01-07杨志伟王圣仪齐鹏宇张进杰

食品科学 2019年24期

杨志伟，王圣仪，齐鹏宇，张昂*，李响，王飞，张进杰

（秦皇岛出入境检验检疫局技术中心，河北秦皇岛 066004）

多酚类化合物是葡萄的重要次生代谢产物和葡萄酒中重要组成成分，主要来源于葡萄、微生物发酵和橡木桶，直接关系着葡萄酒的贮藏时间、色泽、苦味、回敛性等特性[1]，同时具有抗癌、清除自由基及预防心血管疾病等多种功能[2-4]，是葡萄酒中营养成分的主要来源。因此分析葡萄酒中酚类物质的种类和含量，建立同时快速、准确分析葡萄酒中多种酚类物质的方法，可以为葡萄酒行业及相关检测机构提供真伪鉴别和等级评定新方法，对全面评价葡萄酒品质有重要意义[5-6]。

酚类化合物是含有酚官能基团的物质，葡萄酒中酚类化合物根据结构不同主要分为非类黄酮类和类黄酮类[7]，其中类黄酮类根据其分子结构可分为黄酮醇、花色素、黄烷醇类；非类黄酮类主要为酚酸类化合物[8-9]。葡萄酒中酚类物质种类和含量受选用葡萄品种、酿造方式、陈酿方式等因素影响[10-11]。

目前国内关于葡萄酒中单体酚的定性和定量检测，主要有高效液相色谱[12]（high performance liquid chromatography，HPLC）法、高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）技术[13-15]和超高效液相色谱[16-17]（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）法等。许婷婷等[18]利用HPLC法研究了葡萄酒中9 种单体酚的检测方法，检测单体酚种类少且回回率较低；孙翔宇等[19]利用反相-HPLC法和HPLC-MS法同时测定葡萄酒中16 种单体酚含量，检测单体酚种类较少且时间长；张星星等[16]利用UPLC法测定葡萄酒中17 种酚类物质，该方法检测时间较短，但由于葡萄酒中受多种成分影响，很难将全部单体酚分离，因此仅通过保留时间色谱图分析对定量结果影响较大。

UPLC-MS/MS技术可以在HPLC-MS基础上进行2 次质量数筛选，尽可能降低背景噪音。这种技术的检测灵敏度高，近年来以缩短检测时间、分离能力强等优点迅速发展[20-21]。目前国内外学者利用UPLC-MS/MS在检测药物[22-23]或食品[24]中酚类物质的研究较多。Maric等[25]使用UPLC-MS/MS建立了从植物粗提物中原花青素的快速定性定量方法；罗益远等[26]利用UPLC-MS/MS技术建立测定何首乌中二苯乙烯、蒽醌、黄酮和酚酸等共14 种目标成分的方法；Ortega等[27]对UPLC-MS/MS和HPLC-MS/MS测定可可样品中原花青素和生物碱进行比较，结果表明，UPLC-MS/MS技术能够在12.5 min内以低浓度水平测定原花青素含量。

故本实验采用UPLC-MS/MS技术建立快速定性定量分析葡萄酒中29 种单体酚的测定方法，以期为葡萄酒中多种单体酚类化合物的同时检测提供新方法，为葡萄酒相关研究提供方法学基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

单体酚标准品（纯度≥95%）：没食子酸（gallic acid，GA）、原儿茶酸（protocatechuate acid，PA）、(+)-儿茶素（(+)-catechin，CA）、(-)-表儿茶素（(-)-epicatechin，EC）、(-)-表没食子儿茶素（(-)-epigallocatechin，EGC）、(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯（(-)-epigallocatechin gallate，EGCG）、(-)-表儿茶素没食子酸酯（(-)-epicatechin gallate，ECG）、咖啡酸（caffeic acid，CAA）、反式阿魏酸（trans-ferulic acid，FA）、对香豆酸（trans-p-coumaric acid，p-CA）、绿原酸（chlorogenic acid，CGA）、顺式白藜芦醇（cis-resveratrol，cis-Res）、反式白藜芦醇（trans-resveratrol，trans-Res）、顺式白藜芦醇-3-O-β-D-葡萄糖苷（resveratrol-3-O-β-D-glycoside，Res-3-Gly）、山柰酚（kaemperol，Kae）、槲皮素（quercetin，Que）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷（quercetin-3-glucoside，Que-3-Glu）、杨梅素（myricetin，Myr）、桑色素（morin hydrate，Mor）、漆黄素（fisetin，Fis）、芹菜素（apigenin，Api）、木犀草素（luteolin，Lut）、牡荆素-2-O-鼠李糖苷（vitexin，Vit）、原花青素B1（procyandin B1，Pro B1）、原花青素B2（procyandin B2，Pro B2）白皮杉醇（piceatannol，Pic）、香草酸（vanillic acid，VA）、葡萄素（viniferin，Vin）、紫铆因（butein，But）德国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

30-AD液相色谱仪日本岛津公司；Triple Quad™4500三重四极杆-线性离子阱复合质谱仪（配有电喷雾离子源、Turbo V离子源和Analyst 1.5数据处理系统）美国AB Sciex公司；ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）美国Waters公司；Milli-Q去离子水机美国Millipore公司；3-30KS超高速离心机美国热电公司。

1.3 方法

1.3.1 UPLC条件

柱温为30 ℃，进样体积10 μL，流速0.25 mL/min，C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）分离，根据单体酚性质确定流动相A为0.1%甲酸水；流动相B为0.1%甲酸乙腈。洗脱程序：0.00～3.00 min，5% B；3.00～6.00 min，30% B；6.00～9.00 min，50% B；9.00～12.00 min，70% B；12.00～17.00 min，5% B。

1.3.2 MS条件

电喷雾离子源，负离子模式；多反应监测；离子源温度500 ℃；电喷雾电压-4 500 V；气帘气压力40 psi；碰撞气：Medium；雾化气压力60 psi；辅助加热气压力50 psi。

1.3.3 单体酚标准溶液和基质液配制

将29 种单体酚的标准品使用0.1%甲酸-甲醇溶液配制成100 mg/L的标准储备液，于-20 ℃保存。使用时将单体酚标准储备液使用10%甲醇（含有0.1%甲酸）溶液逐级稀释成所需质量浓度标准工作液或混合标准工作液。

将150 mL乙醇和3 g酒石酸移入1 L的容量瓶中，去离子水定容，得到模拟酒样，使用时取出适量模拟酒样，再加入目标质量浓度的单体酚的单标或混标使用。

1.3.4 样品前处理

取1 mL待测酒样用10%甲醇溶液（含0.1%甲酸）稀释100 倍，26 000 r/min离心5 min后取上清液进行测定，根据测定结果重新取样1 mL稀释至适当浓度重复离心，离心后取上清液至进样瓶待测。

2 结果与分析

2.1 前处理优化

图1 3 种滤膜与直接进样比较Fig. 1 Comparison of 3 filter membranes with direct injection

由于直接进样中杂质会对仪器造成影响，而微孔滤膜过滤会对单体酚产生吸附，本实验采用尼龙66滤膜、亲水性聚丙烯滤膜、聚醚砜滤膜和超高速离心沉淀去除杂质后对进样结果进行比较，结果见图1。每种滤膜对不同单体酚的吸附程度存在差异，其中尼龙66滤膜对29 种单体酚的吸附率为36.99%～67.59%，亲水性聚丙烯滤膜的吸附率为39.12%～71.03%，聚醚砜滤膜的吸附率为31.56%～77.39%，由于3 种不同材质微孔滤膜均会对样品产生明显吸附作用，因此为实现标准物质对目标物准确定性定量，本实验选择超高速离心沉淀后直接进样的前处理方法。

2.2 质谱参数优化

采用注射泵直接将标准溶液注入离子源的方式对29 种单体酚质谱参数进行优化。分别将29 种单体酚质量浓度为1 mg/L标准工作液以0.01 mL/min流速将标准工作液注入离子源，负离子化模式下对每种单体酚进行一级质谱分析（Q1），得到母离子峰。在进行目标离子二级扫描（MS2），得到碎片离子。

选取响应最高的2 个碎片离子用于定性与定量，进行条件优化得到相关参数，见表1。

表1 29 种单体酚质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters for 29 monomeric phenols

2.3 色谱条件优化

由表1可知，通过质谱参数已经可以将大部分单体酚进行定性定量分析，但仍有少部分同分异构体结构无法通过离子对区分，因此需要选择最佳色谱柱和流动相进行分离，通过不同保留时间对目标化合物进行定性定量测定。在1.3.1节条件下，29 种单体酚测定结果见图2和表2、3。如图2所示，使用C18色谱柱对29 种单体酚混合标准液的分离条件进行优化，发现其中3 对离子对质量数相同的化合物，trans-Res与Res-3-Gly、CA与EC、Pro B1与Pro B2能够良好分离。对流动相组成和甲酸等条件进行优化，结果表明采用0.1%甲酸-乙腈和0.1%甲酸水作为流动相进行梯度洗脱，得到良好峰形，基质干扰小。

图2 29 种单体酚总离子流图Fig. 2 Total ion current chromatograms of 29 monomeric phenols

表3 单体酚结构Table 3 Structural formulas of monomeric phenols

续表3

2.4 线性关系、检出限及定量限测定结果

表4 方法学验证Table 4 Methodological validation

续表4

在1.3.3节模拟酒基质液中定量加入29 种单体酚的混合标准溶液，分别在0.00、0.001、0.010、0.020、0.050、0.100、0.200、0.500 mg/L水平下测定，分别以目标化合物峰面积（y）对其相应质量浓度（x）绘制标准曲线。按照1.3.4节样品前处理方法制备样品，平行实验6 次，分别在0.01、0.10 mg/L和1.00 mg/L 3 个质量浓度进行添加，计算加标回回率和相对标准偏差，按信噪比3∶1得到目标化合物检出限，10∶1得到目标化合物的定量限，结果见表4。29 种单体酚的定量限在0.001～0.01 mg/L之间，线性相关系数R2均大于0.99，加标回回率在90.8%～104.5%之间，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）在0.26%～7.54%之间。

2.5 实际样品的检测结果

表5 实际样品中单体酚测定结果及稀释倍数（n=27）Table 5 Results of determination and corresponding dilution folds of monomeric phenol in actual samples (n= 27)

为验证方法可行性，对市售的27 种干红、干白与桃红葡萄酒进行检测，其中干红葡萄酒19 种，桃红葡萄酒1 种，干白葡萄酒7 种。由于葡萄酒中的每种单体酚含量相差过大，需先将样品稀释100 倍进行预实验，再根据结果分别将酒样成倍稀释，以保证每种单体酚测定结果都在线性范围内，测定结果及稀释倍数见表5，部分酒样总离子流图与标准品对照见图3。

图3 3 种不同类型葡萄酒总离子流与标准品对照图Fig. 3 Comparative total ion current chromatograms of three different types of wine and reference standards

大多数的干红葡萄酒与桃红葡萄酒可以检出PA、p-CA、VA、GA、CAA、FA、Res-3-Gly、trans-Res、Pic、CA、EC、Que、EGC、Myr、Pro B1、Pro B2、Res-3-Gly、Que-3-Glu这18 种单体酚，与张协光[28]和Leonhard[5]等的检测结果比较，利用UPLC-MS/MS建立的方法能检出更多单体酚类物质，且检出限和定量限更低，能同时对3 组同分异构体进行测定。

这18 种单体酚化合物在葡萄酒中总量在75.560～331.243 mg/L之间，其中儿茶素在多数干红葡萄酒中含量最高。干白葡萄酒所检出的单体酚种类在11～17 种之间，cis-Res、trans-Res、Pic、Myr、Res-3-Gly、Que-3-Glu、Pro B2在部分干白葡萄酒中未检出，且检出这17 种单体酚化合物总量在8～40 mg/L之间，其中GA、PA和Res在干红葡萄酒中的检测结果范围与李巍[29]和赵建勇[30]等测定结果接近。