钙离子添加量对苹果果胶-苹果多酚复配物体系流变、凝胶及质构特性的影响

王撼辰，丑述睿，崔慧军，张舒翼，刘 璇，李 斌,*

（1.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866；2.农业农村部农产品加工综合性重点实验室，中国农业科学院，北京 100193）

苹果果胶是一种常见的果胶，主要结构是以α-1,4-糖苷键连接的多聚半乳糖醛酸链，其酯化度约为75%，糖醛酸质量分数为58.5%，总糖质量分数为92.8%，分子质量通常大于400 kDa。苹果果胶是一种无毒天然食品添加剂，具有良好的凝胶性、稳定性、增稠性和乳化性[1]，因此可作为化工与制药业的原料，其良好的凝胶性和增稠性亦被广泛应用于食品原料中，以提高食品品质。果胶与金属离子的相互作用对果胶的流变性、动态黏弹性和质构特性有着较大的影响。吴健峰等[2]通过钠离子、钙离子和铁离子处理壳聚糖-果胶-阿拉伯胶电解质复配物体系，并通过红外光谱分析和扫描电镜观察，发现金属离子对该复配物体系的膜溶胀度、接触角以及膜结构有显著性影响。Liu Dengfeng等[3]研究发现，钙离子对苹果果胶中的黄原胶流变性有显著提升。Kirtil等[4]通过核磁共振测定了钙离子与果胶甲酯酶复配物对新鲜解冻的芒果果胶细胞完整性的影响，发现经过钙离子处理的果胶甲酯酶效果远优于果胶甲酯酶单独的效果。Gamonpilas等[5]采用钙离子、镁离子和钡离子分别处理柚子果胶，发现这3 种金属离子对柚子果胶的凝胶系数产生显著影响，提高了柚子果胶的凝胶强度，进而提升了整体凝胶性。

苹果多酚是存在于苹果中的功能活性成分，尤其是在未成熟的苹果中含量极其丰富[6]。苹果中提取的苹果多酚具有强大的抗氧化能力[7]，还具有降低胆固醇[8]、调节胰岛素敏感性[9]以及改善肌肉纤维耐力的功能[10]，是制作功能性食品的常用原料。苹果多酚与多糖化合物相互作用后形成的复配物能够整体上改变多糖的微观结构和稳定性，Sivam等[11]对加入苹果多酚制成的面包进行了扫描电镜和核磁共振测定，发现加入苹果多酚的面包微观结构相比只由淀粉和酵母制成的面包有所不同，加入苹果多酚的面包组织屑更为光滑，组织分布也更加均匀。

钙离子在机体生理活动中必不可少，它对于维持细胞膜两侧的电位具有至关重要的作用，钙离子与目前主流果胶-多酚复合型食品的相互作用研究已经成为热点。相关研究表明，适量浓度的钙离子能够提高果胶的流变性、凝胶性以及质构特性，而浓度过高的钙离子则会使果胶的质构特性降低[12]。本研究将上述2 种原料结合形成复配物体系，模拟目前果胶-多酚复合型食品的主要成分，再利用金属离子能够改善苹果果胶流变、凝胶和质构特性的特点，采用钙离子处理苹果果胶与苹果多酚的复配体系，探讨钙离子对该复配体系的影响，从而探究复配体系中钙离子添加量对复配体系流变、凝胶和质构特性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果果胶（食品级，纯度为96%，酯化度75%，相对分子质量889.03） 江莫天宸食品公司；苹果多酚（纯度为92%，相对分子质量436.41，主要成分为绿原酸和儿茶素） 莫发康诺化学有限公司；无水氯化钙、柠檬酸、柠檬酸三钠、蔗糖（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；2-甲基硅油（分析纯） 成都市科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

FA2004A电子分析天平 上海精天电子仪器有限公司；pHS-25酸度计 上海圣科仪器设备有限公司；Discovery HR-1 hybrid流变仪 美国TA Instrument公司；Brookfield CT-3质构仪（Rheo3000软件，可实现对物料从初始屈服应力到流动、松弛、蠕变和恢复的完整流变学行为评估，有3 种配置可选RST-CPS、RST-CC和RSTSST） 中科美仪（北京）科技有限公司；IKA RCT基本型磁力搅拌器（内置PT1000温度传感器，DIN 12878标准接口，可连接外部温度及精确控温） 德国IKA公司；EM-30AX Plus扫描电镜仪 韩国COXEM公司；CT15RE台式冷冻离心机 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的制备

参照梁申[13]的方法有所改动，配制0.1 mol/L pH 3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液1 000 mL。原料添加量参照张卉等[14]的实验配比，方法有所改动，分别用分析天平称取1 g苹果果胶和0.1 g苹果多酚，将其溶解于装有100 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的烧杯中，分别加入缓冲液体积分数0.1%、0.2%、0.3%和0.4%的无水氯化钙，另取一批样品同样按照上述方法配制，但不加入无水氯化钙，作为对照。将所有制得的样品分为A、B两组，A组复配物样品以300 r/min、92 ℃磁力搅拌器进行搅拌，20 min后将转数缓慢调整至600 r/min进行搅拌，20 min后再将转数缓慢调整至1 100 r/min，搅拌30 min后得到不同钙离子添加量处理的苹果果胶-苹果多酚复配物样品，于冰箱中4 ℃冷藏24 h后测定凝胶流变和质构特性；B组经过上述处理后，送入超低温设备，于-80 ℃进行超低温处理48 h，制得的所有样品备用。

1.3.2 流变特性的测定

静态剪切测定：取制备好的苹果果胶-苹果多酚复配物，采用平板-平板测量系统，平板直径为60 mm，间隙为1.5 mm，采用药匙舀取样品，置于流变仪平板中央处，周围涂抹硅油以防止水分蒸发。扫描温度为25 ℃，测定剪切速率0～270 s-1的剪切应力变化。采用Power-Law模型对剪切应力与剪切速率关系的数据点进行回归拟合，用R2表示方程拟合精度。Power-Law方程如式（1）所示：

式中：σ为剪切应力/Pa；K为稠度系数/（Pa•sn）；γ为剪切速率/s-1；n为流体指数。

动态频率扫描测定：扫描温度25 ℃，扫描应变1%，测定频率0.1～100 Hz的储能模量（G’）、损耗模量（G〞）以及损耗角正切值（tanδ）的变化。

动态时间扫描测定：扫描温度25 ℃，扫描应变1%，扫描频率0.25 Hz，扫描时间3 600 s，测定扫描过程中的G’、G〞以及tanδ。

1.3.3 持水性的测定

将复配体凝胶切割为体积均匀的立方体小块，置于50 mL离心管中，放入离心机中测定持水性。6 000 r/min离心45 min，温度为室温，每个样品测量3 次取其平均值。持水性按式（2）计算：

式中：m0为50 mL空离心管的质量/g；m1为离心前离心管和样品的总质量/g；m2为离心后除去水溶液的离心管质量/g。

1.3.4 平均凝胶速率的测定

相关实验表明，以固定速度降温可以更加具体地了解凝胶形成过程中体系结构的改变[15-16]。平均凝胶形成速能够有效地反映凝胶形成过程中弹性的具体变化[17]，按式（3）计算：

式中：G’lst为冷却阶段起始时复配物的弹性模量/Pa；t’lst为冷却阶段起始时间/s；G’End为冷却结束时复配物的弹性模量/Pa；t’End为冷却结算结束时间/s。

1.3.5 质构特性的测定

采用Brookfield CT-3质构仪对复配物进行质地剖面分析（texture profile analysis，TPA）[18]。测定条件：探头P/0.5，测前速率1.00 mm/s；测试速率1.00 mm/s；返回速率1.00 mm/s，触发力35 g；压缩变形程度40%。每组样品测试3 次，取平均值作为实验结果。

1.3.6 微观结构的测定

将制备好的复配物样品迅速倒入90 mm的培养皿中，将培养皿放入超低温设备中于-75 ℃温度下冷冻2 h，取出后放入冻干机中冻干72 h，待样品完全冻干后，放入冷冻干燥箱中，在-55 ℃温度下进行抽真空冷冻干燥72 h，使样品完全干燥。然后将样品置于离子溅渡仪装有双面导电的铝片上，进行喷金处理后进行扫描电镜观察，观测样品表面的微观结构，电压设置为20 kV。

1.3.7 钙离子与复配物体系相互作用模拟

使用ChemDraw 15.0化学结构式绘图软件的绘制反应结构式，模拟钙离子与复配体结构相互作用具体过程。

1.4 数据处理

所有实验均重复3 次，每次测试均需更换样品。采用Power-Law、Origin 9.0、Microsoft Excel和ChemDraw 15.0进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 流变特性分析

2.1.1 静态剪切变化结果

图1 苹果果胶-苹果多酚复配物体系剪切应力随剪切速率变化曲线Fig. 1 Shear stress versus shear rate curves of apple pectin-apple polyphenol mixed system

如图1所示，随着剪切速率的不断增加，苹果果胶-苹果多酚复配物样品经不同添加量钙离子处理后，其剪切应力的变化均呈现出一定的规律性。随着钙离子添加量的逐渐增大，所有复配物样品的剪切应力逐渐升高，同等剪切速率下，钙离子添加量为0.3%时，剪切应力达到最大值，这可能是由于在酸性条件下，钙离子所携带的正电荷与苹果果胶中的负电荷产生了强静电作用，随着果胶添加量的增加，钙离子携带的正电荷逐渐增多并与果胶上的负电荷结合，两者形成稳定的复配物体系，静电作用使钙离子与果胶形成均匀致密的网状结构，整体凝胶强度得到了增强，从而使苹果果胶的流动性增强[19]。然而随着钙离子添加量的继续增大，复配物的剪切应力出现降低现象，表明了流动性的减弱。这可能是由于苹果果胶与苹果多酚的分子间发生了缠结现象，从而削弱了分子的相对流动性，随着钙离子添加量不断增加，钙离子与苹果果胶的静电作用已经饱和，钙离子携带的正电荷逐渐增多，多余的正电荷之间产生了斥力，从而影响了苹果果胶的结构，造成了苹果果胶分子间的聚集，产生了絮凝现象，从而使流动性减弱[20]。

表1 苹果果胶-苹果多酚复配物体系Power-Law方程拟合参数Table 1 Power-Law parameters for apple pectin-apple polyphenol mixed system

如表1所示，以Power-Law为模型对数据点进行拟合，所有样品拟合的决定系数均大于0.95，表现出较高的拟合精度。流体指数是衡量非牛顿流体行为程度的重要指标，若流体指数小于1，则表明测定的流体为假塑性非牛顿流体，流体指数越小，流体表现出的假塑性越强；稠度系数越高表示流体的稠度越高。所测样品的流体指数均小于1，表明经过钙离子处理的苹果果胶-苹果多酚复配物体系呈假塑性流体，钙离子添加量增加时，流体指数先逐渐减小，并于0.3%时达到最低值，说明钙离子添加量为0.3%时，复配物体系稠度系数达到最大，稠度最强。随着钙离子添加量的继续升高，流体指数又开始出现回升，说明钙离子添加量高于0.3%后，稠度系数开始减弱。这可能是钙离子的引入使苹果果胶中的α-1,4-糖苷键在其不可分支的部分与苹果多酚形成了次级键，从而使整个体系相互作用增强，进而提高了稳定性[21]。

2.1.2 动态频率扫描

如图2A所示，在整个动态频率扫描过程中，随着钙离子添加量的上升，复配物的tanδ不断降低，钙离子添加量为0.3%时tanδ达到最小值。说明钙离子添加量低于0.3%时，体系所对应的相位角逐渐减小。而钙离子添加量大于0.3%时，tanδ增大，说明钙离子添加量高于0.3%后，体系所对应的相位角增大。由图2B和表2可知，随着钙离子添加量逐渐升高，G〞的增幅小于G’，复黏度逐渐上升，tanδ于0.3%时达到最小值，此时复黏度达到最大值，说明钙离子添加量低于0.3%时，复配物体系趋于黏性流体，动态黏弹性增强。钙离子添加量高于0.3%后，G’与G〞上则为G’的增幅大于G〞，tanδ增大，复黏度呈下降趋势，说明复配物体系趋于呈非黏性流体，动态黏弹性减弱。这表明，适当添加钙离子能够提高复配物的动态黏弹性[22]。

图2 苹果果胶-苹果多酚复配物体系损耗角正切值（A）和复黏度（B）随频率变化曲线Fig. 2 Frequency-dependent curves of tanδ (A) and viscosity (B) of apple pectin-apple polyphenol mixed system

表2 钙离子添加量对复配物流变性影响动态频率扫描测定参数Table 2 Effect of calcium ion addition on rheological parameters of mixed system determined by dynamic frequency scanning

2.1.3 动态时间扫描

表3 钙离子添加量对复配物流变性指标影响动态时间扫描测定参数Table 3 Effect of calcium ion addition on rheological parameters of mixed system determined by dynamic time scanning

由表3可知，随着钙离子添加量逐渐升高，G〞的增幅小于G’，tanδ于钙离子添加量0.3%时达到最小值，说明钙离子添加量低于0.3%时，复配物体系趋于黏性流体，动态黏弹性增强。钙离子添加量高于0.3%后，G’与G〞均下降，tanδ开始增大，说明钙离子添加量高于0.3%后，复配物体系趋于呈非黏性流体，动态黏弹性减弱，证实了动态频率扫描测定的正确性和准确性。

图3 苹果果胶-苹果多酚复配物体系损耗角正切值随时间变化Fig. 3 Time-dependent curves of tanδ of apple pectin-apple polyphenol mixed system

如图3所示，在3 600 s的测试过程中，始终存在G’大于G〞，表明复配物体系在该阶段表现为弹性固体。钙离子添加量较低时，复配物体系的tanδ不断降低，说明该添加量下凝胶趋于非牛顿流体，并在0.3%时达到最小值，表现出的最强的流动性。而随着钙离子添加量的继续升高，损耗角正切值降低，复配体系的流动性开始产生阻碍现象，整个体系对外界应力的适应能力变差，结构稳定性不断下降[23]。

2.2 复配物持水性的测定结果

图4 苹果果胶-苹果多酚复配物体系持水性随钙离子添加量变化Fig. 4 Water-binding capacity of apple pectin-apple polyphenol mixed system with different concentrations of added calcium ion

果胶的持水性强度主要与果胶的凝胶结构有关，当果胶凝胶结构越稳定时，凝胶的孔径越小，其结构则表现的越为稳定，形成凝胶的持水性也就越强[24]。如图4所示，所有复配物体系的持水能力相差不大，钙离子添加量为0.3%时，持水性达到最强，这可能是由于钙离子与复配物形成的网络结构使复配体形成的凝胶的孔径缩小，导致孔径数量增多，此时复配物形成了致密且均匀的网状结构，复配体对水分子的束缚能力得到了增强，从而提高了持水性。随着钙离子添加量继续增加，复配凝胶体系中可能发生微相分离现象[25-26]，由于复配物体系的分子体积不断增大，钙离子被包裹在复配物的凝胶网状结构中，聚集相体积发生膨胀，导致凝胶的孔径扩增，弱化了结构致密性，从而使复配物体系的持水能力下降。

2.3 平均凝胶形成速率的测定结果

由图5可知，钙离子添加量低于0.3%时，平均凝胶形成速率不断加快，并于0.3%时达到最大值。钙离子添加量高于0.3%后，平均凝胶形成速率降低。这可能是由于钙离子中的正电荷与苹果果胶中的负电荷产生了强静电作用，随着果胶添加量的增加，钙离子携带的正电荷逐渐增多并与果胶上的负电荷结合，两者形成稳定的复配物体系，静电作用使钙离子与果胶形成均匀致密的网状结构，整体凝胶强度得到了增强，从而使凝胶形成速率得到了提高，而随着钙离子添加量的过量，果胶中的负电荷被中和后，多余的钙离子所携带的大量正电荷相互排斥，对复配物的整体凝胶强度产生了影响，阻碍了凝胶的形成，最终使平均凝胶形成速率大幅降低[21]。

图5 苹果果胶-苹果多酚复配物体系平均凝胶形成速率随钙离子添加量变化Fig. 5 Average structure development rates (SDRa) of apple pectinapple polyphenol mixed system with different concentrations of added calcium ion

2.4 质构特性分析

表4 钙离子添加量对复配物质构特性指标影响测定参数Table 4 Effect of calcium ion addition on textural properties of mixed system

如表4所示，钙离子添加量为0.3%时，复配物体系的硬度、弹性、内聚性等质构特性都达到最大值。咀嚼性是衡量以果胶和多酚为原料等复合食品口感的重要质构特性指标。钙离子添加量为0.3%时咀嚼性达到最大值，表明在以苹果果胶和苹果多酚为原料的复合型加钙食品中适当添加钙离子能够提高其的口感，且添加量为0.3%时，口感最佳；弹性能够反映复配体系在外力的作用下发生形变后，恢复原状的能力。随着钙离子添加量的增加，复配物凝胶体系的弹性也在逐渐增强，并于0.3%时达到最大值，这表明复配物体系形成的凝胶网状结构紧密程度达到顶峰，此时的凝胶体系表现出明显的弹性固体特征，这验证了动态频率扫描测定过程中，动态黏弹性的测试结果。然而，钙离子添加量继续升高后，原本的连续型凝胶体系结构转变为颗粒型，复配物体系网状结构遭受破坏，分子间的缝隙增加[27]，最终导致各质构特性指标的降低。

2.5 钙离子对复配物体系微观结构的影响

图6 不同钙离子添加量处理苹果果胶-苹果多酚复配物体系电镜扫描图Fig. 6 Scanning electron micrographs of apple pectin-apple polyphenol mixed system with different calcium ion addition

如图6A所示，复配物体系经低添加量钙离子处理后形成的凝胶网络结构处于一种相对无序的状态，结构互不连接，较为松散，且存在较多的孔径较小的空隙。反映出复配物体系较弱的稳定性、凝胶强度和持水性。

如图6B所示，复配物体系中的负离子与钙离子间开始产生静电相互作用，相分离凝胶结构初步形成，与添加0.1%钙离子的复配物体系凝胶结构相比，该体系凝胶的内部结构开始逐渐相互连接，孔径也开始变得更大，更均匀，体系的凝胶结构开始趋于双连续网络凝胶结构[28]。

如图6C所示，复配物体系凝胶结构发生了显著性改变。钙离子添加量的提高使复配物体系与钙离子间的静电相互作用达到顶峰，形成了致密的网状凝胶结构，复配体系的网孔孔径分布非常均匀且直径达到最大，结构变得更加有序。这种有序的网络结构使复配物体系的凝胶强度显著增强，提高了复配物体系受到外力作用或处于高温时保持一定的抗性能力，凝胶的固态物体特征不易被破坏[29]。该现象证实了动态流变特性的测试中，0.3%的钙离子与复配物体系相互作用时总是比其他添加量的钙离子具有更高的储能模量，凝胶强度和较好质构特性的原因。因此，0.3%钙离子添加到以苹果果胶和苹果多酚为原料的食品中可提高此类食品的质构和稳定性。

如图6D所示，当钙离子加量达到0.4%时，复配物体系开始逐渐形成聚集体，孔径开始变小，凝胶网络结构再次变得复杂无序，凝胶强度不断下滑，从而使稳定性再次变差，该现象与曾瑞琪等[30]研究结果一致。

如图6E所示，随着钙离子添加量的进一步升高，复配物凝胶体系的孔径不断回缩，聚集体的比表面积不断缩小，复配物中暴露在表面的疏水基团和游离电荷急剧减少，导致复配物体系分子间相互交联程度下降，进而表现出弱的凝胶强度不断弱化，稳定性变得更差。

因此，上述结果证实了流变性和质构特性测定中钙离子添加量为0.3%时，复配物体系流变和质构特性都达到最优的结论。

2.6 钙离子与复配物体系相互作用模拟

图7 钙离子与复配物体系相互作用化学结构模拟图Fig. 7 Schematic diagram of the interaction between calcium ions and mixed system

根据Ahn等[31]结论，钙离子添加量的升高能够增强有机物分子膜与有机物分子之间的作用力。因此，除钙离子与复配物体系之间的静电作用外，苹果果胶-苹果多酚复配物体系流变性和凝胶性的增强也可能与复配物分子间形成的氢键、疏水作用力等非共价相互作用有关。如图7所示，通过使用ChemDraw 15.0软件对钙离子与复配物体系的相互作用过程进行模拟，可知随着钙离子的引入，钙离子所携带的正电荷吸附了复配物体系中的负电荷，苹果果胶与苹果多酚之间的分子间形成了氢键，并产生了疏水作用力，进而使分子间作用力得到了增强，复配物体系的凝胶强度得到强化，结构稳定性得到提升。

3 结 论

通过对不同钙离子添加量苹果果胶-苹果多酚复配物体系的流变性、凝胶强度、质构特性进行分析，发现钙离子添加量为0.3%时，复配物具有最强的凝胶强度、动态黏弹性和平均凝胶形成速率。此外，钙离子添加量为0.3%时，复配物样品的弹性、咀嚼性等衡量食品口感的重要指标都达到最佳。钙离子添加量大于0.3%后，复配物的凝胶强度、动态黏弹性等流变性都逐渐变差，凝胶速率开始降低，其质构特性指标也都开始下滑，表明钙离子添加量超过0.3%后，以苹果果胶-苹果多酚复配物为主要原料的食品，其质构与保质性都会变差。因此，苹果果酱、苹果果冻等以苹果果胶-苹果多酚复配物为主要原料的食品若既要保持优质的质构，又要尽可能提高钙离子添加量，以使其更具营养，在此类食品的生产加工过程中，钙离子添加量应控制在0.3%为最佳。通过钙离子与苹果果酱-苹果多酚复配物的相互作用从而改善复配物体系流变性、凝胶性和质构特性的技术能够广泛应用于食品领域，从而弥补目前此类食品质构特性与营养难以兼顾的不足。在后续研究中，将对其他典型化学加工条件对苹果果胶-苹果多酚复配物体系流变性、凝胶性、质构特性和抗氧化活性等性质的影响做更深入的研究。