生物体内抗菌活性物质分离提取研究

汤安英

（贵州医科大学，贵州贵阳 550001）

随着微生物在制药工程中的突破性应用，越来越多的人把目光投向生物抗菌活性物质的应用。各类生物由于生存在不同的自然环境中，其抗菌活性物质作用各不相同。目前，人们已经从各类生物体内提取各种抗菌活性物质并运用于医疗保健、食物防腐等方面。

1 抗菌活性物质来源

1.1 植物内生真菌抗菌活性物质

研究者大多都集中研究植物内生真菌的抗菌活性。植物内生菌是寄生在植物组织中的一大类群特殊微生物，越来越多的研究表明，运用植物内生菌能研制大量新型药物。例如，蛹虫草菌株中抗菌效果较强的CF2菌株对芽孢杆菌的抑制率较高，对酵母菌和黑曲霉菌落的生长也有部分抑制作用[1]；运用牛津杯法和最小浓度测定比较浮萍提取物的体外抗菌活性，结果表明浮萍甲醇提取物、95%乙醇提取物对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌和农杆菌均有不同程度的抑菌效果；该研究表明，结合浮萍的自身特性，对浮萍提取物进行筛选，能显著促进优良药物的开发[2]。此外，丹参内生菌中分离到的一个抗菌生物碱能有效保护丹参免受病原真菌的感染[3]；而艾叶中的抑菌物质主要是艾叶中的挥发油，其具有抗细菌、抗病毒、抗真菌等有效作用，艾叶的水提物还具有一定的抗肝癌活性作用[4]。近年来，廖敏等[5]对阿坝地区狼毒内生放线菌的抗菌活性也有所研究。

1.2 海洋微生物体内抗菌活性物质

随着科学不断发展和进一步的深入研究，研究者对海洋微生物体内分泌的抗菌活性物质也有了初步研究。海洋环境较陆地相比，有高压、高盐、贫营养和低温等突出特点。为适应极其复杂的海洋环境，海洋中的微生物有其独特特征。自人类开发利用海洋资源以来，捕捞业、养殖业、航海业以及工业的快速发展，使海洋的生态系统遭到破坏，生态平衡岌岌可危。海洋微生物以其快速的繁殖速度和强大的适应能力在不断改变的海洋中迅速形成异常环境微生物区系，并通过氧化还原活动来达到并调整新的动态平衡。因此，相对于陆地动植物和土壤微生物，海洋微生物由于其独特的生存和代谢方式，可以产生特殊的抗菌活性物质，对当前的药物研制与开发具有较大作用。

大多数海洋细菌都会产生抗生素，包括假单胞菌属、黄杆菌属、芽孢杆菌属、钦式菌属、弧菌属及许多未鉴定的菌种。海洋假单胞菌中分离得到的抗菌蛋白CAP-1对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等具有广谱的抗菌作用，该蛋白可作为开发无毒抗菌剂的先导化合物。而目前对海洋真菌的研究较多，主要集中于青霉和曲霉，其不管对人类、植物还是水生病原菌都有很强的抗菌活性。目前，只有少数海洋微生物应用于临床研究，但随着对海洋资源的可持续开发，在海洋微生物抗菌活性物质提取方面的成果必将对新型药物产业发展起到重要作用[6]。

1.3 动物体内抗菌活性物质

目前，对动物体内或体表抗菌活性物质的研究较植物和海洋微生物较少，已知的有对东亚飞蝗、黄粉虫、星斑川鲽、草鱼和柞蚕等体内的抗菌活性物质进行分离和提取。由于外源异物刺激，黄粉虫体内的免疫系统会产生一种肽类物质，这类物质具有抗菌或杀菌活性。用各类有机溶剂对黄粉虫幼虫和成虫匀浆物进行浸泡，提取黄粉虫体内的脂类活性物质，发现乙酸乙酯提取物对大肠杆菌、金色葡萄糖球菌、枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌、黄曲霉和黑曲霉的抑菌效果最好[7]。骆雪等[8]发现东亚飞蝗抗菌活性物质粗提液对革兰氏阳性菌（如枯草芽孢杆菌、金色葡萄糖球菌等）或革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、水稻白叶枯病原菌）均有一定的抑制作用，其中对金色葡萄糖球菌的抑制作用最为明显。鱼类黏液中含有大量非特异性抗菌活性成分，在自然条件下可抵抗微量病原菌的侵害，是鱼类先天性免疫系统的重要组成部分。星川班鲽相关免疫组织如脾脏、肾脏、后肠及皮肤黏液提取物对鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和爱德华式菌具有抗菌活性[9]。刘伦伦等[10]发现草鱼肠道抗菌物质的最佳提取条件为乙酸体积分数10%，料液比1∶3.5（g/mL），超声时间10 min，4 ℃下提取24 h，在此条件下的提取物对金黄色葡萄糖球菌和大肠杆菌的抑制作用较好。柞蚕在受到创伤、物理作用、化学物质或病原微生物等刺激后，其体内会合成一系列生物活性物质，包括防御素、溶菌酶、凝集素和柞蚕抗菌肽等，其中柞蚕抗菌肽有较强的抗菌活性。柞蚕滞育蛹血淋巴产生的抗菌活性物质，能使某种大肠杆菌细胞膜破裂，最终因内容物外流而死亡，而此种大肠杆菌正是导致仔猪腹泻的致病菌[11]。因此该抗菌活性物质未来有望在畜牧业饲料添加剂方面有所突破研究，替代或部分替代畜牧业抗生素，具有广阔的发展前景。

2 活性物质分离与提取方法

2.1 有机溶剂提取法

有机溶剂提取法有乙酸提取法[12]、丙酮和甲醛混合液提取法[13]、乙酸乙酯提取法等。刘伦伦等[10]用不同体积分数、料液比、超声时间的乙酸溶液对草鱼鱼肠菌活性物质进行提取，综合研究后发现8%～12%的乙酸提取液的抑菌作用最好。耿俊丽[7]发现采用不同溶剂（无水乙醇、苯、丙酮、乙酸乙酯和石油醚）对黄粉虫幼虫和成虫的匀浆物进行浸泡提取，通过5种指示菌的抗菌效果检测，发现乙酸乙酯提取物的抗菌效果最佳。

2.2 无机溶剂提取法

张希春等[14]发现经硫酸铵沉淀、 超滤和阳离子交换分离得到的蚯蚓抗菌肽 EABP1对鹑鸡肠球菌、绿脓杆菌、鲍氏不动杆菌、土生克雷伯杆菌和粪肠球菌有一定的抑制作用，这为新一代抗感染药物提供了新思路。张雅静[15]发现苦瓜活性物质的水提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，因此通常采用水提取苦瓜活性物质，而非使用有机溶剂，如70%的乙醇溶液等。不同种类的活性物质在不同的溶剂中各表现出不同的抑菌效果，研究者应根据生物体内活性物质的状态、溶解性等各类因素选择相应的提取工艺。

2.3 超声波提取工艺

超声波提取分离是一种依据物质中有效成分和有效成分群体的极性、溶解性和存在状态等特性设计的一种工艺。通过超声波振动的方式，能使溶剂进入固体中，从而使物质中的有机成分溶解于溶剂中，最终得到多成分混合提取液。通过超声波技术不仅可以强化物质的提取分离，大幅度缩减提取时间，提高物质提取分离率，达到节约成本的目的，还可以增加产品的最终产量并提高质量。郭孝武等[16]利用超声波提取黄芩苷，认为超声波提取法比常规煎煮法和浸泡提取法提取效率更高。与常规提取方法相比，超声波提取法所需设备条件要求较高，但提取效率也大幅度提高。研究者在分离和提取生物体内的抗菌活性物质时应综合考虑各类实验条件，选择最合适的提取方法。

3 结语

近年来，对生物体内抗菌活性物质的研究日益增多，研究植物体内抗菌活性物质能促进对植物抗病害新型无公害农药的研制与开发，对我国农业有巨大贡献；研究海洋微生物分泌的抗菌活性成分不仅能使海洋可持续资源得到开发，也能开拓更广阔的海洋研究领域，同时促进大量新型药物的开发。抗菌活性物质在动物体内的发现虽较植物和海洋微生物少，但也说明了在该领域有更大的发展空间。生物于自然界中的生存环境丰富多彩，其自身对于有害病菌和病毒的抵抗能力各不相同。正是因为具有生物多样性，研究生物体内的抗菌活性物质才有价值和意义。在未来研究中，生物体内抗菌活性物质对于新型药物的研制与开发必将起到重要的推动作用。