以植物花器官发育机理研究为切入点进行发育生物学综合实验设计的教学探索*

李巧峡 王 玉 黄永林

（西北师范大学生命科学学院 甘肃兰州 730070）

发育生物学是在动物胚胎学的基础上发展起来的一门学科，主要研究动物胚胎发育模式与发育机理。随着发育生物学学科的发展，它与形态解剖学、细胞生物学、生物化学、分子生物学和分子遗传学等学科之间具有越来越强的依存性和相融性。与该学科相应的发育生物学实验课教学，不仅能加深学生对论知识的理解和记忆，而且在学生的知识结构与认知体系中占有非常重要的地位。目前大多数本科院校主要以动物为材料开设发育生物学实验课，这些实验仅适合简单的胚胎学观察，对于发育机理等分子操作方面的实验，很多学校面临诸多困难，例如材料培养耗时、耗经费，实验仪器缺乏，实验技术支撑不够等。目前，随着植物发育生物学学科的发展，各种材料与技术方法层出不穷。因此，在发育生物学实验中，引入花器官发育等实验，结合发育机理方面的研究进展，更好地培养学生的观察能力、实践动手能力、分析问题与解决问题的能力及科研创新能力。

开花是有花植物生活史中一个重大转折点，是植物由营养生长转入生殖生长最明显的标志，该转折受到环境、生理和基因表达的调控。开花可分为成花诱导和花器官形成等过程。在植物花发育的过程中，一些转录因子相互作用组成一个分子网络，调控花器官的身份与发育。植物一旦诱导成花后，在花分生组织的两侧就会遵循ABC 模型相继发育成花萼、花瓣、雄蕊与雌蕊4 轮花器官。在ABC 模型中，A 类基因调控花萼的身份与发育，A+B 类基因调控花瓣的身份与发育，B+C 类基因调控雄蕊的身份与发育，C 类基因调控雌蕊的身份与发育［1］。如果这些基因发生突变，就会影响花器官的发育及花器官的同源异型转换［2］。A 类基因发生突变的结果是心皮取代萼片，雄蕊取代花瓣；B 类基因发生突变的结果是萼片取代花瓣，心皮取代雄蕊；C 类基因发生突变的结果是花瓣取代雄蕊，雌蕊群则由另一个C 类基因突变花代替［2］。

病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）是利用RNA 干扰诱导植物中目标基因沉默的技术［3］。具有方便、快速的优点，并避开了植物遗传转化的复杂性。由pTRV（pTRV1 和pTRV2）载体介导的VIGS 技术首先在烟草（Nicotiana）中成功建立［5-6］，目前已是一种非常成熟的基因沉默技术，并在多种植物中成功建立［7-9］。因此，以模式植物本氏烟草（Nicotiana benthamiana）为材料，选取ABC 模型中任何一类基因，运用VIGS 的实验方法，让学生理解花器官发育的分子机理，并学会一系列的实验操作方法，可调动学生参与实验教学的积极性和主动性，激发学生的学习兴趣和潜能，培养学生自主式与探究式的学习能力。

1 综合性实验内容

1.1 教师准备环节 为避免与分子实验冲突，缩短实验进程，在实验准备环节，VIGS 载体（pTRV2∶∶探针序列）构建与本氏烟草幼苗培养由教师在课前提前完成。

实验中的VIGS 载体为pTRV1 和pTRV2。已有的探针序列（例如NbGLO1）通过引物引入限制性内切酶酶切位点，pTRV2 用相同的内切酶同时进行过夜酶切，酶切温度参考说明书提供的最佳酶切反应温度。将酶切回收后的cDNA 片段与pTRV2 进行连接，用T4 DNA ligase 连接酶进行过夜连接。连接产物加于50 μL 刚解冻的Trans-T1感受态细胞中，轻弹混匀，置于冰盒中冰浴30 min。42℃水浴锅中热激45 s，立即置于冰上2 min。然后加入500 μL 室温的LB 液体培养基，37℃下200 r／min 孵育1 h。孵育好的菌液取100 μL 涂于筛选平板上（含50 μg／mL kanamycin），37℃倒置培养12～16 h。挑选白色克隆，置于有50 μg／mL kanamycin的LB 液体培养基中，37℃下200 r／min摇菌4 h，取0.5 μL 菌液用作PCR 反应的模板。用156F、156R 正、反向引物鉴定阳性克隆的重组子，并送至公司（华大）进行测序，合适的阳性克隆进行质粒提取，用于下一步的农杆菌转化。

实验中使用的本氏烟草幼苗提前1 个月开始准备。首先在培养皿中进行种子萌发，待种子萌发后，用钝头镊子移至含有营养土与蛭石（体积比为2∶1）的塑料花盆中，继续生长，每个花盆保留1 株苗。植株培养温度为25℃左右，光照强度120 mol／（m2·s）左右、空气湿度保持在48%左右，16 h 光照条件下培养。约1 个月后幼苗长出4 片真叶，即可用于农杆菌注射。

1.2 学生实验环节

1.2.1 植株培养与农杆菌渗入法 用冷冻法将载体质粒转化到农杆菌GV3101 中。将10 μL 的阳性克隆质粒加入50 μL 的感受态农杆菌（GV3101）中，置于液氮中将其快速冷冻，再置于37℃的水浴锅中使其溶解，反复2 次。然后将含有pTRV1 和pTRV2∶∶探针序列（例如NbGLO1）质粒的农杆菌GV3101 分别涂到YEB（含50 μg／mL kanamycin 和100 μg／mL rifampicin）平板上，28℃培养。2 d 后，挑选单个克隆于5 mL 的YEB 液体培养基（含50 μg／mL kanamycin 和100 μg／mL rifampicin）中，28℃，250 r／min小摇过夜。将小摇的菌液进一步用156 引物进行检测，检测是否为阳性克隆。随后将小摇过夜的阳性克隆菌液混合于250 mL 的YEB 液体培养基（含50 μg／mL kanamyin，100 μg／mL rifampicin，10 mmol／L MES 和0.2 mmol／L acetosyringone） 中，28℃，250 r／min 大摇。待菌液在600 nm 处OD 值达到2.0 左右时，收集菌液。菌液进一步用渗透缓冲液 （10 mmol／L MgCl2，10 mmol／L MES，200 mmol／L acetosyringone）重悬，并在室温下孵育3 h，之后将含有pTRV1 和pTRV2∶∶探针序列（例如NbGLO1）质粒的农杆菌GV3101 的渗透液按照1∶1 的比例进行混合。然后用1 mL 无针的注射器将混合液注射到4 真叶本氏烟草所有叶子的下表皮中。暗培养2 d，随后置于光照培养箱，22～25℃、光照强度120 mol／（m2·s）、空气湿度为48%、16 h 光照条件下培养。

在此实验过程中，提出问题引导学生思考：为什么冷冻法能进行目的片段的农杆菌转化？平板上在涂板前为什么要涂相应的抗生素？菌液悬浮为什么要用到MgCl2、MES 和acetosyringone 等药品？转化有pTRV2∶∶目的基因的农杆菌为什么还要混合pTRV1 的农杆菌？注射农杆菌时，为什么要在叶子的下表皮进行注射？

1.2.2 形态观察 将VIGS 后的本氏烟草花芽与野生型对照花芽的不同发育阶段置于体视显微镜下解剖并拍照，得到花芽与各个花器官的发育进程与形态结构。通过形态观察，学生理解花器官发育的过程，思考目的基因（例如NbGLO1）被沉默后，花器官会发生哪些形态变异？花器官为什么会发生形态变异？从而掌握VIGS 实验技术原理与目的基因的功能。

1.2.3 qRT-PCR 分析 VIGS 实验后，为了检验变异花芽中目的基因（例如NbGLO1）的表达量，取本氏烟草花芽为材料（变异花芽与野生型花芽），TRIZOL 法提取总RNA，并将其反转录成cDNA，使用SYBR Premix EX TaqⅡ进行qRT-PCR 分析。用DNAman 软件设计目的基因（例如NbGLO1）的特异引物，以Nbactin为内参基因。扩增程序为95℃变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，共40 个循环。实验过程中使用3 次独立的生物实验样本。采用2-△△Ct 法相对定量分析数据。在此步骤中应让学生理解qRT-PCR 分析基因表达的目的与意义、定量引物设计时需要注意的事项、选内参基因的意义、实验设置对照样本的原因、用3 次独立生物学实验样本的目的等。最后结合花芽形态观察实验，让学生将花芽变异、目的基因表达与目的基因沉默三者有效地联系起来，进一步理解实验的原理与目的，从而达到实验教学的效果。

2 实验的实施与效果

植物花器官发育是植物发育过程中一个重要时期，实验结果与现象明显有趣。在花器官发育机理实验实施过程中，能综合诸如VIGS 技术、PCR技术、植物培养及显微操作等多项技术，可于后半学期进行综合实验课的开设，也可于暑假进行暑期特色实验的开设。同时可拆分成若干个小实验，供学生在合适的实验课时间按部就班地进行实验。在实验课的开设过程中，贯穿以学生为中心的实验教学理念，采用讲解、视频与操作实验相结合的教学方法。教学内容主要包括实验原理、实验目的、实验步骤、实验结果与实验讨论。让学生尽量亲自动手操作实验，同时让学生知其然更要知其所以然。

最后根据学生对实验原理与每一种药品在实验中所起作用的理解，文献的查阅，对实验结果的预测性，以及对结果的观察、描述与解释等方面，对学生进行实验考核。通过本次综合性实验，既让学生理解植物花器官发育的过程与机理，又让学生掌握将来需要的一些实用实验技术，从而充分调动学生参与实验教学的积极性和主动性，激发学生的学习兴趣和潜能，同时培养学生独立思考与自学的能力。

3 思考与结语

发育生物学是生命科学领域的一门主流课程，最近20 多年，该学科领域的理论与技术发展非常迅速。因此，其实验课的开设也应与时俱进，不应仅停留在胚胎发育的形态观察水平，只有将形态观察与分子机理相结合，才能让学生体会到自己所学的课程是与目前学科的发展紧密结合的，才能让学生置身于生命科学学科的发展之中，而不仅仅是一个旁观者。开设综合性实验，对于培养学生的责任心、增强学生的科研兴趣与科研素养等都具有非常重要的意义。