低剂量螺旋CT联合循环肿瘤细胞检测术对孤立性肺结节良恶性诊断的价值分析

宋亚男 齐 宇 张春敭 盛银良 吴 凯 朱森林 刘帅帅 赵 松

即使在科学医疗技术快速发展的今天，癌症依然是人类无法攻克的难题之一。而在众多癌症中，肺癌( lung cancer)在近50年来已悄然成为对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，尤其是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，约占肺癌总量的80%[1]。因其发病隐匿，致病原因繁多的特点，使其发病率和病死率快速增长，数据显示，目前男性肺癌的发病率和病死率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性肺癌的发病率和病死率占第二位[2]。目前虽然对直径较大的实体肺部肿物(直径>3 cm)的诊疗手段日趋完善，但对于直径较小(直径<2 cm)特别是对于直径<1 cm的孤立性肺结节(single pulmonary nodule, SPN)良恶性的诊断标准依然待定，由于未将肺癌控制在萌生阶段，以至于临床上大部分确诊的肺癌患者发现时已基本处于中晚期。所以及时准确诊断是防治早期肺癌的关键，随着低剂量螺旋CT(low-dose spiral computed tomography, LDCT)运用于肺癌的初步筛查，使得较小的肺部结节(直径<2 cm)也逐渐明了[3]，但由于影像学检查的局限性，肺部孤立性小结节良恶性的确定还需依赖后续的侵入性检查，比如CT引导下的穿刺或是支气管镜取活检，但这些侵入性检查经常会由于结节的位置得不到理想的结果，随着循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)检测技术的出现和发展，这些侵入性检测所无法观测到的肺孤立性小结节的良恶性也将逐渐明了[4]。

肺癌的发病率及病死率在世界上所有的恶性肿瘤中都位居前列，而且其发病率正随着工业的发展和环境污染等呈逐步上升的趋势，由于其发病隐匿的特点，且早期诊断率非常低，仅为15%，人们往往容易忽视早期肺癌的微小体征，以至于当人们明显感知有肺部体征时已到中晚期，对比早期肺癌切除后5年生存率为70%以上，中晚期肺癌切除后的5年生存率却仅为20%，这就凸显出了早期诊断是提高肺癌患者整体生存率的关键所在[5]。而肺部小结节(直径<3 cm)特别是孤立性小结节(直径<2 cm)的定性又是整个问题关键。随着高分辨率LDCT运用于肺癌筛查，研究表明，直径>1 cm的肺部结节恶变率高达50%～60%，这是纤维支气管镜和穿刺活检所不能预知的[6]。然而影像学本身的假阳性率又限制了低剂量螺旋CT对于肺部小结节的诊断信任度，而对性质尚未确定的肺部小结节贸然切除又存在过度医疗的纷争，所以对于直径小于2cm的肺部结节往往采取随访的方法，这个看似保险的办法却也最容易延误病情，错过最佳时机。随着大量研究证实了早期肿瘤的外周循环中可以检测出肿瘤细胞，人们对肺部小结节的早期定性又有了新的希望，通过对大量相关文献的阅读分析，笔者认为通过低剂量螺旋CT初步筛查与循环肿瘤细胞检测(CTC)技术相结合将有效提高恶性结节的检出率。本文就低剂量螺旋CT联合循环肿瘤细胞检测术对孤立性肺结节的诊断价值及展望做进一步阐述。

一、LDCT的出现及发展状况

LDCT用于早期肺癌筛查于20世纪90年代开始逐渐被推广，起初由Naildich等[7]提出低剂量螺旋CT应用于肺癌筛查，由于肺组织对X射线吸收率较低且具有高对比度，在理论上是完全可行的.所以从20世纪90年代末开始，多个国家开始了运用LDCT对肺癌早期诊断的研究。日本、丹麦等国家研究表明LDCT较胸部X片具有更高的敏感性和特异性，且能清晰的发现胸部X线片所不能观察到的微小结节，且辐射剂量低，但并没有数据证明LDCT筛查对肺癌的生存率存在影响，而2011年8月美国国家癌症研究所发布研究表明对高危人群行LDCT筛查，可以降低肺癌病死率[8]。

LDCT技术进行肺癌筛查主要原理是应用放射剂量与电流的线性关系，并可有效减低放射剂量，图像具有分辨率高、无重叠等优势。为了最大限度地降低辐射剂量，一般多采用降低管电压、增大螺距、降低管电流等方法。降低管电压虽然可以减少辐射剂量，但X射线穿透力也会随之降低，图像质量会下降。管电流技术目前主要包括管电流自动调节技术、个体化管电流扫描、固定闽值管电流扫描等。目前较新的管电流自动调节技术，能够根据体型和受检部位，对管电流强度值进行调节，在一定程度上补偿图像噪声[9]。

二、LDCT从影像学特征对肺小结节良恶性的诊断价值

影像形态特征包括病灶的内部结构,也包括病灶的外围结构，病灶的内部如分叶征、毛刺征、空泡征等，病灶的外围结构如支气管充气征、胸膜凹陷征 、血管集束征、以及肺和肿瘤的边界特症等[10]，这些形态特征目前仍然是影像科医师对肺结节作出定性诊断的主要依据，回顾不同团队的分析研究，对病理结果明确的GGN的各种征象进行了归纳分析，研究表明侵袭性组和非侵袭性组之间毛刺征和支气管扩张症具有明显统计学差异侵袭性组中出现毛刺症和充气症的概率明显高于非侵袭 性组，而其他征象两组并没有明显的统计学差异。另一项研究报道正常肺组织与肿瘤界面、分叶症及支气管充气征在侵袭性组与非侵袭性组间差异有统计学意义(P=0.02，P=0.00，P=0.048)[11]。虽 然受各种条件的制约使各项研究结果不尽相同，但这些征象的存在为肺结节的定性诊断提供一定依据，然而在临床中很多肺小结节的影像形态学特征并不明显，单纯依靠形态学特征进行诊断具有难 度 。

Eguchi[12-13]报道了两项结果相似的研究，用不同方法对AIS、MIA、I-ADC 平均CT值进行分组研究，组间差异均具有统计学意义。同年在Lim对直径 ≥10 mm且持续存在的pGGN 的一项研究中，AIS 与 MIA两组的平均CT值并没有显著统计学差异，但I-ADC 组的平均CT值明显较其他两组高[14]。这与之前相关研究报道结果均相似。各项相关研究均表明CT值对肺小结节良恶性的诊断确有价值。但有个无法回避的因素始终掺杂在其中，那就是在临床工作中，测量的CT值中往往会包含肺纹理成分，由于个体差异所导致的人体组成并不一致，进而导致测量差异持续存在。

三、LDCT的优点及尚待解决的问题

LDCT 作为肺癌筛查的新方法，对早期肺癌的敏感度明显高于胸部X线片。研究表明，LDCT 检查对早期小肺癌(直径≤20 mm)的检出率约是胸部X线片的10倍，对Ⅰ期肺癌的检出率明显高于胸部X线片，并且检出的肺癌患者的5年生存率有明显提高[15]。在参加筛查的人群中，基线LDCT的肺癌筛出率为0.4%～3.7%，年度复查LDCT的肺癌检出率为0.2%～2.2%。美国国家肺癌筛查试验结果表明，与X线片对肺癌的筛查相比，LDSCT可使重度吸烟肺癌患者的病死率降低20%，这是首次发现 LDSCT 筛查能够降低肺癌病死率[16]。

LDCT扫描方案是通过优化扫描参数，改变管电流.管电压和螺距等来降低辐射剂量。1次常规CT胸部扫描的辐射剂量约为2～27 mSv，为X线片的10～100倍，而LDCT胸部扫描剂量0.61～1.50 mSv，美国医学物理师协会认为如果影响学检查的单次剂量在50 mSv以下，短期内多次累积在100 mSv以下时被认为是安全的[17]，大大降低了受检者的受辐射剂量，这个辐射量是完全符合国际放射委员会对辐射防护正当化及最优化的要求。且有研究表明这种辐射剂量对人体的伤害所带来的利益远大于其本身所带来的伤害。

LDCT的优势在于不仅能够清晰的看显示出肺部结节的二维形态，还能特异性的表现出结节周围组织的影像学特点，比如结节周围微小的血管及走向，都为判断其良恶性及日后手术提供参考。

假阳性率过高是LDCT肺癌筛查中最为突出的问题。临床经验一般认为肺部结节越小，肺癌的可能性就越小。研究报道，小于5 mm的肺部结节中，恶性比例约为3%，而大于10 mm的结节中恶性的比例高达50%左右[18]。NLST中也提到:所有直径>4 mm且没有特定良性钙化的可认定为阳性结节[19]，而在后续3年所初筛的阳性结果中，假阳性结节分别为96.2%，97.6%，94.8%，过高的假阳性率往往会导致医疗资源的浪费，不仅会产生额外的经济和心理负担，更严重影响患者的生存质量。相关研究认为假阳性率增高会增加患者的焦虑情绪，不利于病情稳定，其生活质量严重下降，也让患者对于其准确性产生了质疑[20]。

另外虽有多项相关研究支持LDCT筛查能降低肺癌患者病死率，但其在对肺部小结节定性的准确度上依然存在争议，因为LDCT难以准确测量小结节的生长速度。日本一项肺癌筛查研究估计了LDCT组筛查灵敏度为88.9%，特异度为92.6%，而用发生率方法计算LDCT组筛查灵敏度为79.5%，这表明过度诊断在LDCT筛查中起到了一定作用。Marcus等[21-22]指出如果LDCT筛查有更高的灵敏度，那么LDCT筛查所导致的过度诊断率应该更高。MA根据NLST的数据补充建模分析，对LDCT筛查人群和未筛查人群进行了比较，预估计经历7年随访将有31%的NSCLC患者为过度诊断，其过度诊断的癌症比率为1.38。美国国立卫生研究院一统计学模型预测:经LDCT筛查的高危人群中。每100 000人中将有497例患者被过度诊断。此外仍有多项相关研究证实过度诊断在LDCT肺癌筛查中是常见现象[23]。

在对肺部结节的复查时间上一直存争议，NCCN指南提出了针对结节大小所制定的复查方案：(1)对于实性和部分实性结节，①直径<6 mm，年度LDCT筛查至少2年；②6～8 mm，3个月内复查LDCT，结节无增大，建议6个月复查，仍无增大，1年后复查；③直径>8 mm，建议3个月后复查LDCT；④支气管腔内实性结节，建议一个月后复查LDCT，如未消散，则建议支气管镜检查。(2)非实性结节：①≤5 mm，年度LDCT筛查至少2年，如果持续增大或实性成分增加，建议3～6个月复查LDCT或考虑外科手术；②>5～10 mm，6个月内复查LDCT，结节无增大，进入年度LDCT，结节增大，建议外科手术；③>10 mm，3～6个月内复查LDCT，结节无增大，建议6～12个月内复查LDCT。活检或外科手术；结节增大，或变为实性或部分实性结节，建议外科手术[24]。

四、循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)检测术的兴起及原理

有关CTCs的定义众说纷纭，它是从肿瘤原发灶或转移灶自发或挤压脱落后进入血液循环的肿瘤细胞，它也可以通过主动脱落或被动的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition)过程进入血液循环,尽管对于CTCs迁移入血是发生在肿瘤早期还是晚期尚存疑问，但相关研究表明，当肿瘤直径超过2 mm时便可在肿瘤内形成血管，提供营养，当然这也为肿瘤细胞脱落而进入血液循环提供了可能，Husemann[25]的相关研究更是证明了小于1 mm的肿瘤已经能在循环中检出表达CK及HER2的肿瘤细胞！

1869年Ashworth首次在1例肺癌转移患者外周循环血液中发现了CTCs，这次革命性的发现为后续CTCs检查服务于临床提供了可能[26]。而荧光标记和细胞分离技术的进步，尤其是上皮来源性的CTC检测技术奠定了CTC运用于临床的基础。经过近一个世纪的发展，cellsearch系统(Veridex，Raritan，NJ)应运而生，作为CTCs检测标准评估系统的先驱者，已获得了美国食品药品管理局的批准用于晚期乳腺癌，前列腺癌及结肠癌的检测，这为将来CTCs检测更加广泛的运用创造了可能[27]。

CTCs的检测方法有很多，基本包括分离富集和检测鉴定两个步骤。分离富集通常采用基于CTCs密度和大小的形态特征或分子特征，包括密度梯度离心法，免疫磁性分选法，膜滤过上皮肿瘤体积分离法等；检测鉴定技术根据原理可分为细胞计数法和核酸检测法，如免疫细胞化学技术，流式细胞计数法，RT-PCR检测技术和最具发展潜力的CTCs芯片等[28]。而最为常用的则是基于免疫磁性并同时检测CTCs的CellSearch系统，这也是目前唯一被美国FDA批准进入临床用于CTCs检测及预后评估手段的技术。Cellsearch系统是一个半自动化的检测系统，每次检测仅需7.5 ml的外周血样品，在检测过程中通过包被上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)抗体的磁性颗粒对肿瘤细胞进行富集，因肿瘤细胞属于上皮源性，上皮细胞黏附分子并不表达于血液细胞，所以表达EpCAM的肿瘤细胞可以与抗体特异性结合，通过与血液细胞分离而达到富集的目的。磁珠富集CTCs后，固定细胞并用DAPI荧光核染料标记细胞核，经过细胞内角蛋白荧光抗体CK-PE识别，白细胞荧光抗体CD45检测并排除白细胞，最终符合肿瘤细胞形态特征并表达EpCAM.DAPI.CK-PE和CD45的循环肿瘤细胞就被筛选出来[29]。

五、CTCs检测术的应用现状及发展

研究证明，CTCs广泛存在于乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、前列腺癌和卵巢癌等多种恶性肿瘤中[30-31]。在肺癌方面，目前CTCs检测术主要运用于NSCLC术后的复发转移检测、疗效检测及耐药识别，判断患者预后和化疗疗效评估，但很少运用于肺部小结节的早期诊断。非小细胞肺癌的预后是多因素决定的，目前主要是根据肿瘤的组织类型，TNM分期，临床特征等对患者预后进行判断，但对于估测组织类型和TNM分期均未知的小结节而言，CTCs有着独特优势[32]。多项研究使用Cellsearch系统检测了101例中晚期的非小细胞肺癌患者化疗前后外周血中CTC计数变化，结果提示化疗前CTCs值>5的患者与CTCs值<5的患者相比，其PFS以及OS明显缩短[33]。这说明了CTC值的变化与患者临床预后明显相关。也有研究证实，通过检测CTCs上的生物标志物也能达到判断预后的目的。另一项研究纳入78例晚期非小细胞肺癌患者，使用RT-PCR技术分析其化疗前，化疗1和3周期后血液中CTC的凋亡抑制基因Survivin，对比发现，化疗后血液中Survivin阳性CTC的患者PFS以及OS明显短于阴性患者可。

CTC的提取和富集仍是研究者遇到的首要问题，相关研究表明，CTCs在血液中的含量很少，在患者外周血中提取困难，1 ml外周血中才存在一个CTCs细胞，极大增加了检测的难度，并且部分CTC在发生EMT过程中常发生细胞形态改变，出现间充质细胞属性，而这种改变对CTCs检测技术的敏感性与特异性提出更高要求[34]。

肺非小细胞肺癌患者中的CTC检测的敏感性和特异性仍然存在困难，Cellsearch系统作为CTCs检测标准评估系统的先驱，一项使用 Cell Search 系统检测对比CTC s检出率(样本分别为7.5 ml和 30 ml外周血)的研究发现，CTC检出率分别为67%和87%。基于此研究，Possion 分布统计可以得出 7.5 ml外周血拥有500个 CTC，捕捉﹥1个CTC的几率为50%。Cellsearch其主要是依靠识别上皮细胞标志物来识别CTCs,但是在肺EMT过程用容易丢失这些标记物从而导致该经典方法无效，也同样使通过EpCAM微流体CTCs芯片检测CTCs变得困难[35]；有研究表明，根据上皮肿瘤细胞大小分离法检测CTC的阳性率高于Cellsearch系统，但是其捕获的细胞假阳性率也居高不下，因此具有高敏感度和特异度的捕捉技术仍是临床检测的关键[36]。

六、LDCT联合CTCs检测术的必要性和紧迫性

当前肺癌在我国发病率和病死率居高不下，因此对高危地区、高危人群进行LDCT筛查变得十分迫切，可以明确，目前LDCT虽然作为早期肺癌的初筛首选，被越来越多的人群接受，但新的问题是我们依然对但对于直径<10 mm特别是直径<5 mm的肺部孤立性结节良恶性诊断的束手无策，同时也让研究者深感遗憾。随着CTCs检测术的不断成熟与发展，人们又看到了新的曙光，相关研究早已证实当肿瘤直径超过2 mm时便可在肿瘤内形成血管，提供营养，当然这也为肿瘤细胞脱落而进入血液循环提供了可能[37]。另一项研究更是证明了小于1 mm的肿瘤已经能在循环血液中检出表达CK及HER2的肿瘤细胞，那么直径<5 mm的肺部孤立性肺结节就也有产生CTCs的可能，Mitra等[38]研究结果表示以循环肿瘤细胞计数大于25为临界值，循环肿瘤细胞筛查特异度为100%，敏感度为89%，这就弥补了影像学在小于5 mm肺部肿物的性质诊断的空白。

另外病理组织活检作为诊断肿瘤良恶性的金标准，其侵入性给人体带来了很大伤害，因此很多患者不愿做此类检查而选择继续观察，从而延误病情[39]。病理活检过程中由于机械穿刺破坏肿物完整性，还可能导至人为性的肿物细胞脱落，这也是一个巨大的威胁，由于CTCs检测术的标本为血液，这就很大程度的避免了这种威胁。因此，通过LDCT的初步筛查出GGN，再通过CTCs检测术捕捉相关肿瘤细胞，根据其表面生物标志物对肿瘤细胞进行定性，就可以及时做出相应的治疗措施，从而提高早期肺癌患者的整体生存率，降低病死率。

肿瘤转移及复发的过程均是一个循环肿瘤细胞定植生长的级连放大的瀑布反应[40]。目前肿瘤的发现和诊断仍高度依赖于影像学及肿瘤特异性血清标志物的方法，不能及时发现肿瘤的转移和复发。基于肿瘤细胞播散理论，CTCs检测可能更早发现肿瘤的早期转移，与目前经典的标志物和影像学相比，CTCs检测具有非侵入性、高敏感性、便捷性等优势，其在预后评估、检测复发方面的价值也逐渐凸显出来。

七、展望

LDCT因其放射剂量低、对人体危害程度小、图像具有分辨率高、无重叠等优势逐渐成为肺部肿瘤早期筛查的首选[41]，但是对于肺小结节特别是直径<5 mm的小结节的诊断仍然不明，结节太小而又无法准确进行病理活检，所以按目前对于小于5 mm的肺部结节建议随访的标准，我们很有可能错过了恶性肺小结节，所以随访很有可能延误病情，因此CTCs检测术就很有必要作为LDCT初筛后的补充，对直径<5 mm的肺小结节进一步精确诊断，从而提高肺癌早期诊出的阳性率，降低整体病死率，尽管CTCs检测技术面对很多问题，但研究者们正在做出努力来提高阳性率，如开发新一代CTC芯片，利用多肽纳米磁珠来捕获外周血中的CTCs、采用肺静脉血代替外周血作为样本来提高检出率等，都将预示着CTCs检测术的未来[42-43]。相信在不久的将来，LDCT联合CTCs检测会逐渐取代CT初筛后的病理组织活检等侵入性检查，对于直径小于5 mm肺部结节做出更为准确的判断，进而开启肺癌早期筛查与治疗的新篇章。