火腿中生物活性肽的研究进展

邹颖玲，王桂瑛，*，王雪峰，程志斌，谷大海，徐志强，范江平，普岳红，廖国周，*

（1.云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明650201；2.云南农业大学云南省畜产品加工工程技术研究中心，云南昆明650201）

近年来，随着新兴提取技术的不断完善和科研技术的不断提升，对天然活性肽的研究日渐深入。人类首次发现具有生物活性的肽类物质可以追溯到1902 年，伦敦大学医学院科学家Bayliss 和Starting 从动物胃肠中发现的一种分泌素，具有促进胰腺分泌的作用。通常所说的生物活性肽，是一类具有调节机体新陈代谢、参与生命活动调节或具有某些特殊作用的肽类物质，又称功能肽。分为内源性和外源性生物活性肽，即天然存在活性肽和蛋白酶解活性肽[1]。大多数已知的生物活性肽通常含有2～20 个氨基酸残基，这些残基与特定序列连接，在特殊情况下，这个范围可以扩大[2]。生物活性肽的活性取决于其结构，如氨基酸组成、N 端和C 端氨基酸类型、肽链的重量和长度、氨基酸的电荷特性、疏水、亲水特性、空间结构等。例如，具有血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制活性的肽通常在N-末端含有芳香族或碱性氨基酸，在C-末端含有较多的疏水性和正电荷氨基酸[3]。然而，肽的活性与结构之间的关系仍处于解释阶段。

生物活性多肽在母体蛋白序列中是不活跃的，它可以在食品加工过程中产生，也可以通过微生物发酵或通过化学/酶水解从前体食物蛋白中产生[4-5]。根据氨基酸序列的不同，这些肽可能在体内发挥多种不同的活性，影响心血管、内分泌、消化、免疫和神经系统。迄今为止，在食品中发现的生物活性肽主要有免疫调节、抗菌、抗血栓、阿片类、矿物质结合、抗氧化、抗高血压、低胆固醇等功能特性[6-8]。火腿作为一种发酵肉制品，富含蛋白质，在发酵过程中蛋白质受到组织内源性酶以及微生物酶的作用，降解产生许多小分子肽段[9]，有些研究表明部分肽段具有生物活性，因此本文主要综述了火腿中生物活性肽的产生机制、功能特性、制备方法以及分离纯化的研究进展，旨在为生物活性肽进一步的研究与开发利用提供参考依据。

1 火腿中生物活性肽的产生机制

火腿的整个加工时间很长，从腌制到成熟要经历冬、春、夏、秋4 个季节，一般传统的加工过程长达8～10 个月，在此期间内源性酶伴随着环境的温湿度变化而表现出不同的活性。由于特定的温湿度条件，使得肌肉蛋白质和脂肪在相应的酶作用下发生降解产生许多长短不一的多肽、游离氨基酸、脂肪酸等产物。火腿中肽的分子量大小与火腿的加工时长关系密切，加工时间较短的，所产生的肽的分子量较大。反之，肽的分子量较小，而分子量大的肽会因加工时间的延长进一步降解为分子量较小的肽[10]。引起蛋白质发生水解作用的酶类有多种，如内源组织蛋白酶、微生物酶等，其中内源组织蛋白酶B、L、H、D、钙激活中性蛋白酶等内切酶起主要作用，在火腿的整个加工过程中组织蛋白酶B 或B+L 活性始终良好[11]。而外切蛋白酶如三肽酶、二肽酶、氨肽酶、羧肽酶等会对低分子量小肽的产生具有重要作用。火腿中蛋白水解作用会经过3 个阶段，其变化与通过Z 盘肌原纤维的破碎程度有关[12]：蛋白组织关键性内切酶B、L 等首先对肌浆蛋白和肌原纤维蛋白进行水解，产生许多蛋白质碎片以及中等大小的多肽，然后外切酶二肽酶、三肽酶再将其进一步降解为短肽。Rodriguez 等[13]研究了Sarrano 火腿加工中肽的生成，结果表明火腿中多肽的组成可分为5 个分子量范围，即 4 500 Da～2 700 Da、2 700 Da～1 200 Da、1 200 Da～500 Da、500 Da～375 Da 和 375 Da～160 Da。Zhao 等[14]的研究结果表明金华火腿加工过程中蛋白质会发生不同程度的降解，并从晒腿结束、成熟中期、成熟后期3 个时期的火腿中分别鉴定出43、46、63 种主要的小肽。这说明了火腿加工过程中会产生和积累大量多肽及小肽类物质。对于火腿中产生的肽类物质的功能特性有待进一步的研究，以完善其功效。

2 火腿中生物活性肽的功能特性

2.1 ACE抑制活性

肉类蛋白衍生生物活性肽研究最广泛的是血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽[7，15]。这些多肽因其能预防高血压而备受关注，高血压是心血管疾病发展的危险因素，是当今最常见的慢性生活方式相关疾病（chronic lifestyle-related diseases，CLSRDs）之一。ACE 抑制肽可作为有效的功能性食品添加剂，是一种天然、健康的高血压药物替代品。血管紧张素转化酶I 是一种二肽酰羧肽酶，它能将一种非活性形式的血管紧张素I 转化为有效的血管收缩剂血管紧张素II。ACE 是一种多功能酶，能使一种已知的血管舒张剂失活，还可以发挥抗高血压作用[15]。在食物蛋白的酶水解产物中发现了大量的ACE 抑制肽[16-17]，食物中分离的ACE 抑制肽对正常血压无影响，具有天然性、高安全性的优点。同时，食源性ACE 抑制肽有促进降血糖血栓、增强人体免疫力等复合功效。目前，已有国内外学者对火腿中肽的ACE 抑制活性进行了体外试验和动物实验研究。Mora 等[18]的研究指出，自发性高血压大鼠摄入伊比利亚干腌火腿的肽提取物8 h 后，收缩压显著下降了12 mmHg，分析结果鉴定了2 632 个含有上述ACE 抑制片段的肽序列PPK、PAP 和AAP。有人研究了干腌火腿加工过程中自然产生的肽，显示出ACE 抑制活性，还研究了肽在Caco-2 细胞单层的跨上皮转运过程中的稳定性，结果显示其能够被肠道上皮吸收并到达血流以发挥抗高血压作用[19]。在体外试验中，水溶性成分和洗脱组分都显示出体外血管紧张素转化酶抑制活性。在最近的研究中[20]，已经检测了一种富含ACE抑制活性肽的西班牙干腌火腿提取物在热处理和体外消化过程中的稳定性。结果表明，加工的西班牙干腌火腿提取物中的肽在差热50 ℃～117 ℃前后、不同时间和模拟体外消化过程中几乎保持了相同的ACE 抑制活性。肽 KAAAAP、AAPLAP KPVAAP、IAGRP KAAAATP是最活跃的，IC50值在 12.37 μmol/L～25.94 μmol/L 之间。Escuderoa 等[21]的研究指出，在西班牙干腌火腿中发现了新的具有体外ACE 抑制活性的序列，并且在体内这些序列也有抗高血压活性。王乐等[22]通过研究金华火腿加热烹饪以及加热烹饪-体外模拟消化后提取的粗肽发现其均具有ACE 抑制活性和抗氧化性，经比较发现从处理过的金华火腿中提取的粗肽的ACE 抑制活性更高。综上，火腿活性肽具有较强的ACE 抑制活性，通过适当的处理会增强它的活性。相关研究大多从体外ACE 抑制试验对其评估，缺乏体内试验、细胞试验等的验证，ACE 抑制机制也尚未清楚，还需全面深入地研究。

2.2 抗氧化性

自由基是带有一个或几个不成对电子的原子、分子或基团，通常化学性质不稳定，有夺取电子的倾向。随着对自由基的深入研究，生物体患的多种疾病以及出现的衰老问题均与体内产生过量自由基有关[23]。自由基是生物体正常新陈代谢的重要参与者，如羟自由基、超氧阴离子和一氧化氮自由基等。人体衰弱或机体衰老时，不能完全清除体内的自由基，过多的氧自由基堆积在细胞内会与大分子物质，如蛋白质、核酸、脂质等发生反应，产生大量的氧化物或过氧化物，对人体细胞组织产生破坏，而抗氧化酶和抗氧化物质可保护生物分子免受自由基的侵害[24]。天然抗氧化肽具有清除自由基、抑制脂质氧化、螯合过渡金属离子和降低细胞自氧化速率，并且能够有效捕获并中和自由基从而减少自由基对人体损坏的一类活性物质。已有研究人员从动植物、微生物、水产品以及乳制品中获取了抗氧化肽[25-29]，并证实了其具有清除自由基能力、活性高、安全低毒等优点。据研究表明，干腌火腿中存在生物活性肽，其具有抗氧化、降血压、抑菌等活性。郑锦晓等[30]研究了宣威火腿、金华火腿和如皋火腿中多肽的抗氧化性，发现3 种火腿均具有铁离子还原能力和ABTS+自由基清除能力、氧自由基清除能力和一定的DPPH 自由基清除能力，且宣威火腿的铁离子还原能力和ABTS+自由基清除能力、氧自由基清除能力均高于其他两种。王乐等[22]的研究表明，金华火腿具有一定的抗氧化性，加热烹饪后，金华火腿粗肽的ABTS·+清除率和Fe2+螯合能力降低，而DPPH 自由基清除率和氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）有所提高；加热烹饪-体外模拟消化金华火腿后 Fe2+螯合能力、ABTS·+清除率和 ORAC 均升高，这些结果显示出评价其活性的指标发生了变化，虽然它的变化趋势不完全一致，但仍存在一定的活性。周小理等[31]研究了金华火腿水提物体外抗氧化活性，结果表明，金华火腿水溶性提取物及超滤后的不同分子量的分离物均具有较高的抗氧化活性，其中，水溶粗提物的抗氧化活性随着浓度的增大而增强。从结果中可以看出抗氧化活性与分子量大小有关，分子量越小，抗氧化活性越强。Escudero 等[21，32]研究了西班牙干腌火腿，结果表明，西班牙干腌火腿中含有抗氧化肽和抗高血压肽，部分肽段具有DPPH 自由基清除活性和超氧阴离子清除能力。邢路娟等[33]对从宣威火腿中提取的粗肽进行了体外抗氧化试验，结果表明，宣威火腿发酵过程中所形成的粗肽物质具有抗氧化活性。吴宝森[34]对诺邓火腿粗肽进行了体外抗氧化试验及分离纯化与鉴定，结果表明诺邓火腿粗肽具有一定的抗氧化性，且随着质量浓度的增大抗氧化活性增强；通过鉴定得到了8 个抗氧化肽序列。Xing 等[35]研究了宣威火腿中粗多肽的体外抗氧化活性，发现其具有较高的抗氧化活性。研究表明火腿中的肽具有较高的抗氧化活性，大多数研究是从体外抗氧化试验来评价它的抗氧化作用，缺乏动物实验、临床试验、细胞试验等，抗氧化需要多种检测方法来综合评价，而且各种火腿由于发酵条件不同产生的抗氧化肽也不同，需全面深入地研究其发酵过程中的变化规律。

2.3 抑菌性

抗菌肽一般是指能抑制或杀灭微生物的多肽或寡肽，是宿主非特异性防御系统的重要组分，多数抗菌肽由12～60 个氨基酸残基组成，相对分子质量小于10 kDa。抗菌肽通常有两亲结构，N 端含亲水性氨基酸残基，C 端含疏水性氨基酸残基，这使抗菌肽能与两性分子构成的细胞膜结合。Castellano 等[36]对西班牙干腌火腿粗肽进行分离并测定其抑制李斯特菌的能力，通过液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-MS/MS） 鉴定得到具有较好抑菌能力的肽段RHGYM。郑锦晓等[30]的研究结果表明，金华火腿、宣威火腿和如皋火腿中粗多肽有抑制大肠杆菌的能力，且抑制大肠杆菌的能力随着肽浓度的升高而增大。目前，国内外对干腌火腿多肽抑制微生物能力的研究鲜有报道，具有潜在的研究价值。

2.4 其他

火腿多肽还具有其他的功能特性如乳化性等，它是由于多肽的双亲性，使其在食品中扮演着乳化作用的角色，其乳化性对产品的质地和口感起着重要作用。食源乳化性的肽因其具有易吸收、毒性小或无毒副作用等优点而备受青睐。肽的乳化性与食品加工和食品质量控制关系密切，而蛋白肽的乳化性与蛋白质结构有关，蛋白质水解之后，分子量降低，离子基团数量增加，使疏水基团暴露从而改变多肽的性质。有研究者[37]研究了金华火腿粗多肽的功能特性，发现其具有良好的乳化特性，乳化能力、乳化稳定性指数、黏度均与多肽浓度呈正相关，乳状液粒径随着多肽浓度的增加而减小，乳化活性指数与浓度呈负相关。这一研究弥补了金华火腿乳化特性的研究空白，为完善火腿的功效提供理论依据。

3 火腿中生物活性肽的制备与分离纯化

3.1 生物活性肽的制备

生物活性肽的制备方法有多种，比如直接提取法、酶解法[25]、微生物发酵法[38]等。而火腿中的肽一般采用盐酸或磷酸盐缓冲液来提取，罗雨婷等[39]用0.2 mol/L pH 7.2 的磷酸缓冲液从诺邓火腿中提取出具有抗氧化性的粗肽；郑锦晓等[30]用磷酸缓冲液从金华火腿、如皋火腿、宣威火腿中提取了具有抗氧化活性和抑制大肠杆菌的粗肽；Escudero 等[19，31]用 0.01 mol/L 盐酸溶液从西班牙火腿中提取出具有抗氧化性和抗高血压的短肽；忽晓平[37]研究了盐酸、磷酸盐缓冲溶液两种浸提液和乙醇体积分数对金华火腿粗多肽提取效果，结果表明，偏酸性条件下，金华火腿中多肽提取效果较好。通过研究金华火腿粗多肽中含有抗氧化性和乳化特性；郑锦晓等[40]用磷酸缓冲液提取传统工艺和新工艺金华火腿中的粗肽，结果表明，传统工艺粗肽粉的肽含量显著高于新工艺的，且两种加工方式中的粗肽具有不同的抗氧化性；韩冬雪[41]用不同体积（5、10、15、20、30 mL）相同浓度的盐酸（0.01 mol/L）提取了发酵牛肉火腿中的ACE 抑制肽，结果表明，用15 mL 0.01 mol/L的盐酸提取更合适，这是由于蛋白质浓度达到一定时，随着盐酸量的增加，提取物中蛋白质含量也会降低导致的；马志方[42]用0.01 mol/L 盐酸提取了低钠金华火腿中的多肽，研究结果表明，低钠金华火腿具有抗氧化活性和ACE 抑制活性。在提取活性肽时，不同的提取条件获得的活性肽可能不同，同时也可能会影响活性肽的稳定性，在今后仍需要进一步研究。

3.2 生物活性肽的分离纯化

分离纯化是生物活性肽研究中的重要部分，为了进一步研究肽的生物活性及其作用机制，常用的分离纯化方法有凝胶色谱法、离子交换层析[43]、超滤法[44]、反相高效液相色谱法[45]等，这些方法各有利弊，常常将几种方法结合使用来分离纯化多肽。胡亚亚[46]通过Sephadex G-25 凝胶色谱对金华火腿粗肽液进行分离得到5 个组分，其中组分C 表现出最强的清除DPPH自由基和超氧阴离子自由基的能力。忽晓平[37]采用超滤法对金华火腿粗多肽进行分离，得到了分子量大小为＞10 KDa、3 KDa～10 KDa、＜3 KDa 的 3 个肽段，经研究3 个肽段均具有一定的乳化性和抗氧化性，且分子量越小，抗氧化性越强。吴宝森[34]利用Sephadex G-25凝胶色谱和Sephadex G-15 凝胶色谱分离纯化粗肽后，通过体外抗氧化试验得出组分C3的抗氧化活性最强，进一步通过MALDI-TOF-MS 鉴定C3组分得到8个抗 氧 化 肽 序 为 ：QVTSLSGQcHHHDEK、VHQYFN VGLIQPGSVK、QNLLSQSHAHQQFLR、GcFKPIVAGD -QNVEYK、AIQISYNPEDLSKPDR、NLHPELGTDADKE -HWK、IRELESQISELQEDLESER、IHVSDQELQSANASVDDSRLEELK；祝超智[47]借助凝胶层析色谱对金华火腿粗肽液进行初步分离，通过抗氧化试验和模拟胃肠道消化试验，分别选出消化前后活性强的组分采用反相高效液相色谱进一步分离纯化，用质谱鉴定出了7 条具有抗氧化活性的肽段，其中，清除羟基自由基活性最强的肽段为LPGGGHGDL。Xing 等[48]通过使用阴离子交换柱和反相高效液相色谱分离宣威干腌火腿中抗氧化活性较强的组分，利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS） 鉴定得到 ASP-LU-Glu Glu、SerPro Gly Pro、Ser-GLY-TYR 和 PRO-LU-PRO 是宣威火腿抗氧化活性的主要肽类。Escuderoa 等[21]利用尺寸排阻层析和反向高效液相色谱纯化西班牙干腌火腿提取物中水溶性多肽后，用纳米液相色谱串联质谱鉴定得到最有效的ACE 抑制肽序列为AAATP。目前用于纯化火腿多肽的方法有多种，但一种单一的分离纯化方法难以获得高纯度、单一组分的火腿多肽，因而需要采用几种方法联用才能获得高纯度的活性肽。

4 结论与展望

生物活性肽具有多种功能特性，含有多种潜在的对人体健康有益的生物活性，如抗氧化性、ACE 抑制性、免疫调节、抗血栓、抗癌、抗炎等，对开发功能食品、营养保健品以及食品添加剂等具有潜在可能性。火腿在长期的发酵过程中，由于蛋白水解作用产生许多小分子肽类物质，经研究发现部分肽段具有生物活性。国内外对火腿生物活性肽的研究起步较晚，目前，从火腿中发现的活性肽有抗氧化肽、ACE 抑制肽、抑菌肽，对这些活性肽的研究还较少而且不全面，主要是对其进行体外试验来评价它的活性，对于活性肽的分离纯化以及空间构象的研究较少，缺乏细胞试验、临床试验、动物试验等来检测活性肽的作用机制。人们主要研究了西班牙干腌火腿、宣威火腿、诺邓火腿与金华火腿中的部分活性肽，对其他火腿活性肽的研究较少。不同地区的火腿，气候、地理环境以及加工工艺之间存在差异，使其发酵条件不同，导致火腿在发酵过程中蛋白水解程度不一样，产生的生物活性肽也会有差异。综上所述，火腿中的生物活性肽具有很大的研究意义，需进一步加强研究，以期能够开发出对人体有益并具有特殊功能特性的肽类产品。