揭秘人类先天无痛症的病理基础—电压门控钠通道Nav 1.7在人类痛觉中的功能作用

1.研究背景

编码电压门控钠通道 (VGSC) NaV1.7的SCN9A的双等位基因突变失活，会导致人类先天无痛症(congenital insensitivity to pain, CIP) 的临床表型。CIP病人对有害刺激不会感知到疼痛，无论是机械的、热的还是化学物质的刺激模态。相反地，NaV1.7功能获得型的突变已被证明会导致诸如人类遗传性红斑肢痛症 (inherited erythromelalgia) 和阵发性极度疼痛症 (paroxysmal extreme pain disorder) 等孟德尔遗传疾病。最近发现NaV1.7功能获得型突变也与更为常见的如小纤维神经病变和痛性糖尿病神经病变等获得性疼痛病有密切联系。NaV1.7在周围神经系统的伤害感受器神经元和交感神经元上高度富集表达，也在大脑皮层下的结构中表达，包括丘脑、内侧杏仁核、下丘脑和嗅上皮投射到嗅球的轴突等。有趣的是，嗅觉缺失是NaV1.7的双等位基因功能丧失型突变的唯一其他临床特征。这些发现激起了人们对靶向调控NaV1.7来开发新型镇痛药的强烈兴趣。

目前，研究人员已经启动了多个靶向调控NaV1.7的药物开发计划，包括小分子阻滞剂和生物学方法。对于药物开发来说，选择性靶向NaV1.7通道是必需的。但是，由于不同VGSC亚型的高度同源性，所以选择性靶向NaV1.7通道变得非常有挑战性。目前，VGSC的非特异性阻断剂（如一些抗惊厥药物）常用作镇痛药。然而，无选择地靶向多个VGSC通常会在心脏和中枢神经系统 (CNS) 中导致明显的剂量限制性的不良反应。目前，缺乏对CIP的基础病理机制的了解是镇痛药物研发的一个关键障碍。人们尚未明确CIP病理发生的确切部位，而这对于确定新型NaV1.7阻断剂是否需要穿过血脑屏障具有重要意义。人们也不清楚阻断NaV1.7对感觉神经系统的结构或功能的发育是否存在影响，从而造成即使采用高效的急性药理学阻断的方法也无法复制CIP的临床表型的原因。

在啮齿类动物中，NaV1.7表达在初级感觉神经元的外周末端、轴突、胞体和中枢末端。目前，人们已经制作出全身性敲除或在部分感觉神经元中条件性敲除NaV1.7的突变小鼠模型。在行为学测试中，这些小鼠对有害热刺激、机械刺激和化学刺激产生的退缩反射行为有所降低（尽管在某些情况下并不完全缺失）。有趣的是，看起来并非所有的疼痛行为（如热痛觉过敏）的减轻都是外周感觉神经元自主介导的，其也有可能涉及与交感神经系统的相互作用。在感觉神经元中条件性敲除NaV1.7的小鼠也表现出神经性疼痛和炎性疼痛降低的行为学表型。此外，在全身性敲除NaV1.7的小鼠中，伤害感受器对皮肤的神经支配也是正常的。

研究人员已经对上述这种的行为表型提出许多并不互斥的机制来加以解释。在外周伤害感受器末端，NaV1.7的通道动力学特性使其作为阈值通道，能够行使对微小信号进行放大的职能，并提示NaV1.7在动作电位发生中扮演关键角色。NaV1.7对动作电位沿轴突的传导也可能是必要的。此外，在感觉神经元的中枢末端，NaV1.7也可能以一种类似于嗅觉系统的方式来调控神经递质的释放。最后，NaV1.7可能与其他信号系统也有密切联系，例如内源性阿片系统。内源性阿片类物质在NaV1.7功能缺失的条件下表达上调，并反过来抑制背根神经节 (DRG)神经元胞体末端的兴奋性。

目前，人们仍然需要对CIP病人的躯体感觉神经系统的功能障碍更好地进行研究和表征。在啮齿类动物DRG神经元中，缓慢的膜去极化会触发由NaV1.7激活所驱动的兴奋性斜坡电流，这是由于通道的慢闭合状态失活所产生的。研究者认为这些电流对微小的阈下去极化刺激进行放大起重要作用，从而增加神经元爆发动作电位的可能性。最近的一项研究发现，健康捐献者遗体的人源DRG细胞缺乏低阈值的兴奋性斜坡电流。研究者对人源NaV1.7的药理学工具药的通道选择性提出了质疑，但无法获得NaV1.7缺失的神经元来最终明确这一点。他们提出，人源DRG神经元中NaV1.7的表达可能相对缺乏。进而提出尽管NaV1.7对啮齿类动物的河豚毒素 (TTX) 敏感钠电流有重要贡献，但在人类中的情况却可能并非如此。但是，另一项研究结果发现NaV1.7的mRNA是人源DRG组织中主要表达VGSC的基因之一，这与上述结果相悖。

最近，人们已经发展了用于研究人类伤害感受系统的详细结构和功能的相关技术。本文作者采用了一种多模式技术方法，包括感觉分析、显微神经造影术、功能性脑成像、利用人类诱导性多能干细胞 (iPSC) 模型并与基因组编辑相结合的方法等，来详细描述NaV1.7在人类伤害性感受系统中的功能作用。

2.研究结果

（1）CIP病人的感觉特征分析：本文作者招募了3名CIP病人来对其感觉神经功能进行评估。所有受试者SCN9A基因均已被确认含有杂合突变，并预计会导致该蛋白质的功能丧失。3名受试者均报告了自己从童年开始遭受的多次无痛性受伤，包括无痛性骨折。在临床检查中，研究者发现了3名受试者的嗅觉缺失，并感觉不到针刺痛的感觉，因此符合典型的SCN9A基因突变相关的CIP临床表现。定量感觉测试(QST) 发现，受试者对于有害的温度刺激和机械刺激都没有感觉到疼痛，也证实他们对疼痛不敏感。与德国神经疼痛协会所制定的标准参考值相比，受试者手和脚的冷暖检测阈值降低，热感觉阈值也受损，表明热感觉迟钝，但机械觉和振动觉的检测阈值正常。因此，QST数据显示受试者的大纤维功能基本正常，而小纤维功能受损。

在局部施加致痛剂或致痒剂可激活皮肤中化学敏感性C纤维并诱导神经肽的释放，引起神经源性的发红反应 (Flare) 并导致疼痛或痒觉。在CIP病人的前臂和手掌表面施用组胺和芥末油可引起发红反应。但是，受试者没有报告自己有疼痛或瘙痒的感觉。而健康对照组报告施加芥末油时均出现强烈的“刺痛”和“灼痛”感。在用离子电渗法施加组胺之前就使用局部麻醉剂，组胺引起的发红反应消失，表明该反应是由神经活动所介导。结果表明，至少CIP病人尚存在一些对有害刺激有反应的皮肤神经纤维，可以在此过程中产生小范围的动作电位。

除了一名受试者外，其他受试者下肢的运动神经和感觉神经的神经传导参数均在标准参考范围内。这名受试者的腓肠感觉神经的动作电位的振幅较小。由于该受试者下肢先前曾遭受多处伤害，因此进行神经纤维记录变得非常困难，而动作电位振幅的降低可能是由于过去的创伤所致。因此除了这名受试者，功能性神经生理学评估未发现CIP病人大纤维功能的任何异常。参照年龄和性别匹配的标准参考数据，本研究所有受试者小腿的表皮内神经纤维密度 (IENFD) 的测量值低于第一四分位的5%。但是，在所有受试者的皮肤中的确观察到了更深的真皮神经纤维的分布。因此，IENFD的测量结果提供了CIP病人发生小纤维病变的证据。此外，还观察到所有受试者的大腿近端表皮内神经纤维的缺失或明显减少。

（2）CIP病人SCN9A基因突变对NaV1.7通道功能的影响：本文作者将新发现的NaV1.7的突变体在HEK293T细胞中进行异源表达，并使用全细胞膜片钳记录来评估其对NaV1.7通道生物物理学特征的影响。对转染细胞的全细胞电压钳实验结果显示，所有的突变都大大降低了NaV1.7电流。FS1773的突变导致NaV1.7通道电流密度产生8倍的降低。R896W、R830X和G1725R的突变导致电流密度降低到可忽略不计，提示这些突变导致其严重的功能丧失。由此可知，与对照相比，所有CIP病人的NaV1.7突变都会导致NaV1.7通道的电导显著降低，这与通道功能几乎完全丧失的观察是一致的。

（3）显微神经造影术显示CIP病人C纤维型伤害性感受器缺失：本文作者记录并分析了来自3个受试者的共38根C纤维（来自1号CIP病人的4个神经内位点的14根纤维，来自2号CIP病人的3个神经内位点的7根纤维和来自3号CIP病人的6个神经内位点的17根纤维）。这些记录都未能鉴定出与C-伤害性感受器神经元性质一致的纤维类型。不同神经纤维的传导速率的活动依赖的衰减(ADS)现象出现的不同频率为：I型（代表C型感受器）(0%)，II型（代表热感受器）(26.3%)，III型（代表低阈值C机械感受器）(13.2%)和IV型（交感性传出纤维）(60.5%)。用2 Hz刺激期间，所有神经内位点均显示具有“平台”单位的ADS现象。由于缺乏I型纤维，这种感觉传入纤维类型的频率与健康人的正常参考数据存在显著差异。因此，代表了C-伤害性感受器神经元存在的神经纤维传导速率的ADS现象，在CIP病人是明显缺乏的。记录的三种C纤维类型传导速率的ADS现象与先前记录的ADS数据没有显著差异。

（4）辣椒素诱发的脑区激活水平在CIP病人显著降低：尽管CIP病人具有明显的临床表型，但先前的研究未能发现CIP病人对急性伤害性机械刺激产生的脑活动与健康对照组的差异。但是，该研究中用于比较的方法学受到了质疑，这使得该研究结论的正确性变得扑朔迷离。

在一名愿意进行功能性脑成像的2号CIP病人上，本文作者使用动脉自旋标记成像法研究其对辣椒素诱发急性疼痛的大脑反应。这种方法排除了机械刺激的干扰，从而有效避免了先前存在的数据分析和整合的问题。用1%的辣椒素软膏处理健康受试者(HC)的皮肤引发疼痛反应，而在CIP病人未能引起类似的反应。CIP病人在测试的任何实验条件下都没有报告任何疼痛和不适感。这与HC组的结果正相反，辣椒素刺激和热刺激在HC组产生疼痛体验。在HC组，初级和次级躯体感觉皮层、背外侧前额叶皮层、岛叶（前、中、后）、前扣带回、壳核、伏隔核、导水管周围灰质和小脑中都观察到脑血流量 (CBF) 显著增加。而在CIP病人，大脑对“热+辣椒素”的反应与“休息”状态的唯一区别是在初级躯体感觉皮层、背侧前扣带回和后扣带回中观察到CBF的增加。为了确认CIP组与HC组辣椒素诱发的热痛状态下观察到的脑血流量变化与独特的知觉体验有关，本文作者将神经病学痛特征(NPS) 引入并应用于这些数据分析。NPS是加权的多变量脑激活图谱分析，与实验性疼痛的程度密切相关，故可以用于成像数据分析以预测扫描期间可能经历的疼痛严重程度。对于每个受试者，NPS的结果是通过将NPS的点积 (dot product) 与“热+辣椒素＞静止”状态的对比图像相乘而得出的。对于CIP病人而言，NPS的结果是根据“热量+辣椒素＞静止”状态的六个重复试验的平均值生成的。对于HC组而言，NPS是根据12位受试者的一次扫描的平均值得出。与CIP组相比，在HC中观察到的NPS值的波动明显更大。实际上，辣椒素引起的急性热痛敏产生的脑活动NPS值在CIP病人没有重叠，而在HC组的有重叠。

（5）NaV1.7在iPSC伤害性感受器神经元中富集表达，并被转运至特定的神经元部位：人iPSCs定向分化为伤害性感受器神经元可以作为功能模拟的平台在体外研究CIP发病机理，并且对NaV1.7在人伤害感受器的生理功能提供重要发现。本文作者使用了先前描述的定向分化方案，培养生成了表达Brn3a（感觉神经元标记物）的高纯度神经元。分化成熟的iPSC伤害感受器神经元与人初级感觉神经元在分子水平上具有相似性，体现在其能够对有害刺激做出合理反应，并具有成熟神经元的电生理学特性。本文作者进一步通过RNA测序证实了iPSC伤害性感受器神经元的分子特性。主成分分析表明，iPSC伤害性感受器神经元与先前发表的研究结果以及hDRG组织的数据具有良好的聚类关系。与其他组织相比，iPSC伤害性感受器神经元具有高度相似的DRG神经元的分子特征（由hDRG组织数据中的富集基因组成）。本文作者也发现SCN9A的表达水平很高且与hDRG组织数据相似。然后，试图检查NaV1.7蛋白在iPSC伤害性感受器神经元中的亚细胞分布情况。鉴于靶向人源NaV1.7通道的市售抗体质量不佳，而阻碍了研究者对NaV1.7通道准确的亚细胞定位。因此，本文作者决定使用CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术来标记内源性NaV1.7，将高度抗原性的抗原决定簇标签血凝素(HA)框内敲入一个SCN9A等位基因C末端，用来标记所有的NaV1.7转录本的功能性编码产物。

本文作者检查了iPSC分化后NaV1.7表达的时程变化。结果发现，在iPSC伤害性感受器神经元分化成熟过程中，NaV1.7蛋白的表达和定位存在显著差异。NaV1.7在培养的iPSC细胞中并不表达，但在成熟的iPSC伤害性感受器神经元中高度富集表达。在体外培养25天的未成熟的iPSC伤害性感受器神经元中观察到NaV1.7的表达水平很低，且NaV1.7蛋白质表达在胞体并集中在核周半环结构（即内质网）。与之相比，在体外培养60天后成熟的iPSC伤害性感受器神经元中，观察到NaV1.7显著富集表达在细胞膜表面和整个轴突。先前报道NaV1.7可定位在啮齿动物DRG神经元的轴突末端。与此一致的是，染色结果显示iPSC伤害性感受器神经元末端富集表达NaV1.7。先前发现与大鼠施万细胞共培养时，iPSC伤害性感受器神经元可以在体外有效地被髓鞘化。在揭示了无髓鞘的人伤害感受器神经元中NaV1.7丰富表达后，接下来研究了在有髓鞘的共培养体系中NaV1.7的亚细胞定位情况。观察到NaV1.7表达定位于有髓鞘轴突中的90%以上的郎飞结中（该结节由MBP蛋白的表达来区分和界定）。在培养体系中存在的未成熟的郎飞结，NaV1.7通道分布集中但明显拉长，这与郎飞结旁组织富集VGSC到郎飞结的作用一致。在体内，C纤维与非髓鞘形成的施万细胞结合形成Remak纤维束。因此，还研究了在未诱导髓鞘形成的共培养体系中，施万细胞对NaV1.7定位的影响。NaV1.7定位在与非髓鞘形成的施万细胞相平行的轴突上。这与没有施万细胞存在的情况下相类似。这些结果表明，NaV1.7高表达在iPSC伤害感受器神经元中，并被适当地转运至极化的神经元亚细胞结构中。

（6）NaV1.7调控iPSC伤害性感受器神经元的兴奋性：为了探索NaV1.7参与伤害性感受器神经元的生理功能，本文作者从健康人和CIP病人中获得了iPSC伤害性感受器神经元。来源于1号CIP病人的2个克隆 (cCIP1.1和cCIP1.2) 和2号CIP病人产生的1个克隆 (cCIP2)，来源于健康人的3个克隆 (HC1、HC2和HC3) 用作对照。人类和啮齿动物的伤害性感受器神经元在动作电位的下降相表现出“弯曲”现象。因此，为了选择性记录成熟的iPSC伤害性感受器神经元，只记录了表现出该特征的神经元的动作电位。在静息状态时，健康人和CIP病人的iPSC伤害性感受器神经元的生物物理特性（包括膜电位）没有显著差异。在评估放电性质时，CIP病人来源的iPSC伤害性感受器神经元的兴奋性低于对照组。与对照组相比，CIP病人来源的iPSC伤害性感受器神经元需要更大的电流刺激才能产生一个动作电位，并且持续(500 ms)阈上去极化刺激所产生的动作电位数目更少些。为了确认所观察到的神经元兴奋性降低是由于NaV1.7功能的丧失所致，使用CRISPR- Cas9纠正了CIP1.2克隆的一个SCN9A的等位基因，将c2488c ＞ t的突变纠正为野生型基因序列。与CIP1.2克隆相比，纠正后的克隆细胞显示出基强度变小，并达到与健康对照组类似的情况。而基因纠正并不能逆转持续阈上去极化刺激所产生的动作电位减少的现象。这些结果与CIP病人隐性遗传的性质一致，但也表明SCN9A的两个功能性拷贝是神经元维持持续重复性放电所必需的。

为了研究不依赖于CIP病人之间遗传背景的NaV1.7的功能作用，本文作者将纯合的SCN9A移码突变(N842X) 引入到健康对照组的iPSC (HC1)细胞，产生了NaV1.7敲除的品系 (NaV1.7 KO) 。这个新的突变在通道的结构域II过早地产生了终止密码子，使SCN9AmRNA转录本产生无义突变而导致降解。NaV1.7 KO的iPSC伤害感受器神经元复制了在CIP组中观察到的兴奋性改变的表型，包括基强度的增加和阈上刺激诱发重复放电频率的降低。最近有报告提出，NaV1.7功能丧失而产生CIP的表型至少部分是由于内源性阿片类药物（特别是前脑啡肽PENK）的上调所导致。在该研究中发现，纳洛酮（一种阿片类药物拮抗剂）可以反转一名CIP病人无痛的临床表现。本文作者测试了纳洛酮能否使NaV1.7 KO品系的神经元低兴奋性实现正常化，发现纳洛酮不影响NaV1.7 KO神经元的兴奋性的参数，从而表明阿片样物质的上调并不参与调节NaV1.7 KO神经元低兴奋性的表型。与此一致的是，qPCR分析发现健康对照组或NaV1.7 KO的iPSC伤害性感受器神经元中未检测到PENK的mRNA。RNA测序分析结果发现，对照组的iPSC伤害感受器也未检测到PENK的mRNA的表达。全细胞电压钳记录结果发现，与对照组相比，NaV1.7 KO的神经元的电压门控钠电流的峰值降低了23.89%，这一发现与小鼠中NaV1.7对小直径伤害性感受器神经元中的电压门控钠电流的贡献相一致。伤害性感受器神经元的外周末端受到刺激很可能会产生感受器电位，导致膜电位缓慢地去极化。NaV1.7通道展示了缓慢的关闭状态失活特征，这使通道能够打开继而响应斜坡去极化并且启动动作电位的生成。为了探讨NaV1.7在神经元响应缓慢的去极化刺激中所起作用，以渐增梯度注入阈上斜坡电流，以模拟感受器电位。NaV1.7 KO的iPSC伤害性感受器神经元对斜坡电流去极化刺激（特别是对较慢刺激）的反应明显较迟钝。CIP病人来源的iPSC伤害感受器神经元与对照组相比反应也较慢。这些结果证实了NaV1.7在iPSC伤害感受器神经元调节兴奋性状态中的作用。先前报道NaV1.7功能获得性突变与体外感觉神经元的神经突生长的改变有关。鉴于在CIP病人中发现皮肤IENFD降低的现象，所以试图验证缺乏NaV1.7的iPSC伤害感性受器神经元是否存在神经突生长缺陷的问题。成熟的iPSC伤害性感受器神经元在其培养阶段会发育产生大量的神经突起。本文作者量化了这些神经突起所覆盖的面积，发现NaV1.7敲除后iPSC伤害性感受器神经元与对照组之间没有显著差异。与啮齿动物DRG相似的是，当iPSC伤害性感受器神经元被机械打散时，会在数小时内再生出神经突起。与对照组相比，缺乏功能性NaV1.7的伤害感受器 (CIP和NaV1.7 KO) 神经元打散12 h后，产生的神经突起的投射覆盖的面积与对照组类似。在神经突起发育完全的神经元中，各组之间的神经突起平均长度也没有差异。这些结果表明，在体外培养条件下，NaV1.7功能的丧失不会对神经元内在的神经突起的生长产生影响。

（7）NaV1.7 KO的iPSC细胞可作为止痛药物筛选的平台：鉴于SCN9A功能丧失型基因突变与CIP病人之间的遗传联系，研发NaV1.7的特异性抑制剂已成为制药公司寻求生产新型镇痛药的主要目标之一。本文作者认为，NaV1.7 KO的iPSC细胞可以作为一个筛选NaV1.7特异性抑制剂的平台。BII074是一种状态依赖性的钠通道阻断剂，认为其可能对NaV1.7具有亚型选择性。最近研究证明，BII074在临床上是安全的且对三叉神经痛病人有一定疗效。BII074（在与临床相关的浓度范围内）剂量依赖性地增加了神经元基强度，并降低了对对照组iPSC伤害感受器的慢斜坡去极化刺激的反应，这与其NaV1.7的阻断作用相一致。浓度为2～10 μM的BII074（在BII074治疗的病人血浆中的浓度范围）对NaV1.7 KO神经元的基强度没有影响。但是，在BII074的浓度适当增加（25 μM）的情况下BII074对NaV1.7的选择性消失，表明BII074在该浓度下可调节其它非NaV1.7通道，从而影响神经元的兴奋性。在体外实验中，BII074优先抑制高频刺激诱导的神经元放电，这种情况可能发生在阵发性疼痛发作期间（例如在三叉神经痛病人中经常被报道）。本文作者在以20 Hz注入150%基强度的电流阶跃，并检测了去极化激发神经元产生动作电位的能力。鉴于NaV1.7从失活中恢复得很缓慢，因此其不太可能在该频率刺激诱发动作电位中发挥作用。BII074剂量依赖性地阻断了对照组以及NaV1.7 KO神经元的高频放电。该结果表明，在NaV1.7缺乏的情况下，BII074依然能抑制神经元的放电。这提示在此浓度下，BII074还“脱靶”作用于其他靶标。

PF-05089771是一种芳基磺酰胺类的NaV1.7的强效抑制剂，并正在进行糖尿病性神经痛和遗传性红斑肢痛病的临床试验。在体外使用PF-05089771的浓度为接受治疗的病人中测得的血浆中游离的PF-05089771的浓度。PF-05089771增加了对照组伤害性感受器神经元的基强度，而对NaV1.7 KO伤害性感受器神经元的基强度没有影响。PF-05089771在任何测试剂量下均不影响两组神经元的高频放电。该结果表明，PF-05089771在功能水平上对iPSC伤害性感受器神经元的兴奋性的作用依赖于NaV1.7。

3.讨论

本文作者发现，CIP病人的无痛表型不仅由于伤害性感受器神经元的兴奋性低下，而且由于这些传入感觉纤维发生了重要的结构变化。在细胞学水平上，使用人iPSC来源的伤害感受器神经元对CIP进行了机制研究。结果显示，NaV1.7定位于伤害感受器神经元的特定亚细胞结构，并且在调节神经元兴奋性中至关重要。证明了iPSC来源的伤害感受器神经元平台还有助于明确靶向NaV1.7的镇痛化合物的选择性问题。

本研究纳入的CIP受试病人都是SCN9A突变的复合杂合子类型，均能导致NaV1.7电流的显著降低。R896W、R830X和G1725R的突变可导致NaV1.7通道几乎完全丧失功能，而位于通道C端的FS1773突变可导致NaV1.7电流密度降低8倍之多。先前研究的大多数CIP病人中， NaV1.7突变导致通道完全丧失功能。但是，最近另一篇论文也报道了许多与CIP相关的SCN9A的突变，还残存一些钠电流（尽管电流大幅降低）。FS1773等位基因与R830X配对作为复合杂合子，未观察到电流。因此，在CIP病人体内NaV1.7突变体几乎不可能产生电流。

所有受试者的临床表现均与双等位基因SCN9A突变继发的CIP表型相一致。他们在一生中都没有疼痛体验，在定量感觉测试和给予致痛物质也是一样，并且他们的嗅觉缺失。受试者的感觉缺陷不仅限于疼痛感知，CIP受试者对温暖或是对凉爽也不敏感，提示他们的热感觉受损。这些感觉模态由C和Aδ纤维所介导。先前报道给CIP病人施加组胺后依然会有发红反应，本文也重复了这一发现。然而，以前没有注意到的是，尽管神经源性的红肿反应在CIP病人得以保留，但这种刺激并没有引起CIP受试者产生痒的感觉。这可能反映了这样一个事实，即致痛剂和致痒剂做出反应的主要传入感觉纤维有很大的重叠，其中大部分表达NaV1.7。在瘙痒行为的临床前模型中，用抗体来阻断NaV1.7功能的动物对瘙痒的反应较少。最近的一份报道介绍了在成年后NaV1.7功能缺失，导致其对组胺和氯喹刺激引起的瘙痒行为消失。而大直径纤维介导的感觉模态（例如振动和轻触觉）的检测在CIP病人则是正常的。

本文作者进行了许多电生理学测试来研究NaV1.7突变对体内感觉神经功能的影响。VGSC突变以及与VGSC结合的药物和毒素可改变人神经元的兴奋性参数。因此，进行了感觉神经兴奋性测试，但未发现CIP病人有任何明显变化。造成这种情况的可能原因是感觉神经动作电位（用作阈值跟踪的测量指标）主要由大直径有髓鞘神经所介导。但在啮齿动物中，据报道只有15%的中等直径和大直径有髓鞘DRG神经元是NaV1.7免疫阳性。此外，这些神经元还表达其他TTX敏感的VGSC（如NaV1.1和NaV1.6）。这一发现表明，在NaV1.7阻断剂的临床试验中，神经兴奋性参数不太可能成为有用的生物标志物。因此，进行了显微神经造影术，可以直接测试小直径的感觉和交感神经纤维、C纤维和Aδ纤维的活动。

关于腓浅神经的显微神经造影术的发现令人震惊。本文作者使用先前公认的标准，即自然激活和传导速度的ADS现象，可以记录和鉴定具有C和Aδ低阈值热感受器特性的小直径纤维以及交感传出神经。但是，在CIP病人没有记录到任何具有伤害性感受器神经元特征的C纤维类型。在健康受试者中，使用相同的实验技术确定的伤害性感受器神经元的C纤维比例约占腓浅神经所有C纤维的60%。重要的是，将电刺激施加在腓浅神经的神经支配区域作为搜索策略，因此排除了使用自然刺激产生的假设的“搜索偏见”。显微神经造影术未检测到C型伤害性感受器神经元的另一种可能的解释是：实际存在的C纤维由于NaV1.7突变而无法被激活，故无法通过微神经成像技术检测到。该解释与本研究在iPSC伤害性感受器神经元的低兴奋性的发现相一致。另一种可能的解释是CIP病人在解剖学上缺乏C型伤害性感受器神经元，这是在皮肤活检实验中得到的结果。

传统观念认为外周小纤维结构在SCN9A突变引起的CIP病人中是正常的。先前的SCN9A突变病人的神经活检结果正常。研究者认为这可以将SCN9A突变引起的CIP与由其他原因引起的CIP（如神经生长因子NGF突变）区分开：NGF突变会导致伤害性感受器神经元的发育严重退变。令本文作者惊讶的是，在所有3个SCN9A突变引起的CIP病人中，远侧腿的表皮神经支配明显减少。这些CIP病人的IENFD远低于年龄和性别匹配的健康人的正常参数。先前2个病例报告中也显示出了受试者在身体远端部位的IENFD减少。

IENFD减少的一种可能解释是由于CIP病人先前身体受伤所致。因此，本文作者还从大腿部位进行了皮肤活检。身体近端大腿的神经支配密度高于远端腿。在CIP病人中几乎没有观察到表皮神经纤维。但仍然可以观察到真皮神经纤维，结果提示，在人类中NaV1.7是伤害性感受器神经元轴突远端末梢维持长期结构完整性所必需的。最近的案例报告描述了在一位SCN9A突变导致CIP的年幼病人（2岁女孩）体内，其IENFD已经大幅降低。CIP病人IENFD的丧失可能是由于NaV1.7功能丧失导致神经元在生命早期的死亡或者胚胎发生过程中正常C纤维型伤害性感受器神经元的发育异常。本文的体外研究未能观察到缺乏NaV1.7的iPSC伤害感受器神经元神经突起生长存在缺陷。然而，对内源性伤害性感觉传入纤维对表皮的支配需要复杂的环境和化学线索，且其轴突需要长距离投射。鉴于本文作者的培养系统中无法完全建立此类模型，因此，在这种情况下，不能排除NaV1.7缺失在上述过程中发挥作用。NaV1.7对IENFD减少的贡献可能是由于神经元的低兴奋性或是该通道的非典型作用。

在人类中观察到的结果与在NaV1.7基因缺陷小鼠中的结果不一致：在NaV1.7基因缺陷小鼠中，表皮的神经支配是正常的。在人类（而非小鼠）中IENF缺失的原因一直还未找到。对此可能的解释是，在这两个物种之间，神经活动依赖的C纤维末梢结构的维持机制可能会有所不同，特别是考虑到人类需要维持更长的轴突。

尽管CIP病人完全无痛，并且实际上其表皮几乎完全失去神经支配，但CIP病人依然存在正常的发红反应。发红反应是由于皮肤C纤维激活后导致轴突反射介导的神经肽释放到皮肤的毛细动脉上所介导。如果所有的C纤维都已经退化，那么将不会出现发红反应。CIP病人的发红反应依然得以保存的事实表明，至少在真皮内缺乏NaV1.7的C纤维末端仍然可以维持短程动作电位的传播（且足以诱导神经肽释放），即使无法继续向神经干传导信号。

这些在体实验的发现预示了在对CIP病人施加有害刺激后，从周围伤害性感受器神经元输入到脊髓以及随后到高级脑中枢的信号将显著减少。在一个受试者中，本文作者使用动脉旋转标记进行了fMRI以验证这一假设。使用先前的方法，将致痛源（辣椒素和热刺激）施加到腿部。这一操作在CIP病人中并未引起任何疼痛，但对于对照组受试者来说却非常疼痛。研究者还在CIP受试者中的初级体感皮层、背前扣带回和后扣带回中观察到CBF的升高。但是，对照组CBF在皮质网络中更广泛且显著的增加，包括初级和次级的体感皮质、背侧前额叶皮层、岛突、前扣带回、壳状核、伏隔核、导水管周围灰质和小脑。NPS是一种基于功能性磁共振成像的测量方法，这一方法已被证明可以用来预测疼痛强度。使用NPS测的响应值显示，CIP病人的NPS反应和辣椒素引起的急性热痛觉过敏而产生的脑活动之间没有重叠。相比之下，对照组中强烈的NPS反应反映出这些受试者的NPS和与疼痛相关的大脑活动明显重叠，这与人们强烈的疼痛体验密切相关。这些数据都是通过脑部扫描期间收集的疼痛报告所得到的。先前的一项研究将CIP病人与健康对照组进行比较时，未发现在使用Neurosynth软件识别的先定义的兴趣优先级区域内血氧水平依赖性功能磁共振脑功能成像 (BOLD) 反应的差异。然而，他们的方法遭到了来自方法学和有关数据整合的质疑，这使得出的结论产生局限性。上述研究与本文作者的研究之间存在许多关键性差异，这些差异限制了将两组研究结果直接相比较，包括脑成像方法、疼痛研究方式和所采用的分析流程的比较。至关重要的是，本文作者使用了局部应用辣椒素来诱发疼痛。众所周知，辣椒素通过选择性激活伤害性感受器神经元在对照组中会引起中度至重度疼痛，并且不会因低阈值机械性感受器的共同激活而产生干扰。本文作者得出结论，CIP病人中缺乏伤害性感受器神经元驱动的疼痛，并且与健康对照组有不同的脑激活方式。因此，该结果支持了作者的外周皮肤实验的结论。

为了更好地理解NaV1.7突变如何影响感觉神经元的兴奋性问题，本文作者使用了iPSC伤害性感受器神经元与基因编辑相结合的方法。首先研究了在iPSC伤害性感受器神经元中NaV1.7的表达情况和亚细胞定位。NaV1.7沿着全长的轴突在细胞膜上大量表达，并在轴突末端结构中富集表达。与先前啮齿动物中报道一致，NaV1.7也适当地定位于有髓鞘轴突郎飞结中。

与啮齿动物中NaV1.7 KO 的DRG研究结果一致的是，本文作者观察到了来源于CIP病人的iPSC伤害性感受器神经元的确是处于低兴奋性状态，表现在激活电流阈值的增加和阈上刺激诱发动作电位发放的降低。这些表型在NaV1.7 KO的iPSC伤害性感受器神经元中得以复制，并在来源于CIP病人的iPSC伤害性感受器神经元中得以复制。在来源于CIP病人的iPSC伤害性感受器神经元中，SCN9A的一个等位基因被基因组编辑纠正为野生型序列。有趣的是，在基因组编辑纠正的iPSC伤害性感受器神经元中，放电阈值已完全恢复正常，而对阈上刺激诱发动作电位的发放却没有影响。结果表明SCN9A的两个功能拷贝对人类伤害感受器兴奋性的设定可能是必需的。

本文作者利用NaV1.7 KO的iPSC伤害性感受器神经元可以进一步研究通道活性与伤害性感受器神经元功能之间的联系。最近有报道表明，NaV1.7对人类感觉神经元中全钠电流的贡献可能非常有限。与此观点相反的是，本文作者发现NaV1.7通道在iPSC伤害性感受器神经元中提供了全钠电流峰值的约24%。

先前研究者未能在人DRG体外记录到TTX敏感的低阈值斜坡电流，并且使用选择性毒素和阻断剂评估NaV1.7对TTX敏感的全钠电流的贡献时，产生的结果并不一致。Pro-Tx II无法抑制TTX-S电流，而PF-05089771则会完全抑制该电流。本文作者推测，在更天然环境中研究钠通道（而不是在异源表达系统时），Pro-Tx II会失去效力或者PF-05089771会失去选择性，而这两种钠通道抑制剂在先前的研究中均显示有效且是特异的。结果表明，至少就功能结果（即放电特性）而言，PF-05089771对NaV1.7具有通道选择性。该结论补充了本文作者得到的缺乏NaV1.7功能的iPSC伤害性感受器神经元低兴奋性的发现。本文作者得出结论，NaV1.7通道对神经元的兴奋性的确有重要贡献。鉴于NaV1.7在转录水平上是人类DRG中表达最丰富的VGSC通道，如果说该通道在感觉神经元中没有发挥重要的生理学作用，那才是令人惊讶的！健康捐献者来源的DRG的分离和培养以及本文作者的iPSC分化策略，提供了研究人类感觉神经元生物学的两种不同方法。iPSC定向分化成伤害性感受器神经元具备体内伤害感受器神经元的许多转录和功能特征，但可能并不能囊括DRG感觉神经元的整个全貌。如今尽管人体来源的DRG越来越普及，但是对非常罕见的疾病（例如CIP）的研究仍是一个严重挑战。iPSC的基因修饰可以对基因功能进行精细的编辑，从而消除了对药理学研究来说固有的化合物选择性方面的问题。

本文作者发现缺乏NaV1.7（无论是来自CIP还是NaV1.7 KO品系）的iPSC伤害性感受器神经元仍能够在细胞体上产生动作电位，尽管需要更大的电流刺激。这一发现与计算机仿真建模和动态膜片钳记录结果相一致，后者描述了NaV1.7的电导与激发单个动作电位的阈值以及阈上去极化刺激而激发动作电位发放之间呈线性关系。在完全不存在NaV1.7的情况下，伤害性感受器神经元仍能够在细胞体上产生动作电位。这些研究结果与本文作者的发现相一致。

NaV1.7的通道动力学特性使其可以将小的去极化电流放大，并调节神经末端动作电位的生成。本文作者试图通过逐渐使膜电位去极化的分级阈上刺激，来更好地在体外模拟神经末梢的感受器电位。NaV1.7 KO的iPSC伤害性感受器神经元的反应能力明显低于对照iPSC伤害性感受器神经元，特别是对较慢的去极化刺激的反应更是如此。NaV1.7在伤害感受器的初始生成和动作电位传导中起必要作用，这与本文作者在CIP病人的显微神经造影术的发现相一致。临床前数据显示，NaV1.7可能会调节伤害感受器神经元中枢末端的神经递质释放。鉴于周围神经内缺乏功能性伤害性感受器，因此伤害感受传递的缺陷与伤害性感受器神经元的中枢末端相距较远。故本文作者认为伤害感受器神经元中枢末端的缺陷不太可能对CIP病人的无痛表型做出主要贡献。

本文作者还利用了NaV1.7 KO细胞来进行药理学评估。尽管内源性阿片类药物在功能性NaV1.7丧失的情况下被上调，并参与了CIP病人无痛表型的发生，但没有看到NaV1.7 KO的 iPSC伤害感性受器神经元中PENK mRNA的上调，或在对照神经元中的表达。支持这一发现的是，本文作者观察到的NaV1.7 KO的iPSC伤害性感受器神经元中明显的低兴奋性不依赖于内源性阿片类信号。在体外培养的iPSC伤害性感受器神经元的实验结果，并不能排除在没有NaV1.7的情况下，中枢阿片机制对CIP病人无痛表型的贡献。本文作者利用NaV1.7 KO品系，来测试在临床开发中的NaV1.7选择性小分子的特异性问题。PF-05089771是一种芳基磺酰胺类的NaV1.7选择性阻断剂，针对原发性红斑肢痛症和糖尿病性神经痛正在进行II期试验。用PF-05089771处理对照的iPSC伤害性感受器神经元可降低其兴奋性，但对NaV1.7 KO神经元并无影响，表示该药物对NaV1.7的选择性很好。BII074已成功进行三叉神经痛的II期临床试验。发现临床相关浓度的BII074 不依赖于NaV1.7的效应随剂量增加而急剧增加。特别是BII074对伤害感性受器神经元的使用依赖性的阻断效应似乎在很大程度上不依赖于NaV1.7。这可能与三叉神经痛（阵发性疼痛）的关联特别密切。尽管该药物在II期临床试验中耐受性良好，但本实验结果提示，由于存在脱靶的风险，不要试图增加BII074的剂量来增强治疗效果。

综上所述，本文作者对由SCN9A突变引起的CIP临床表型进行了详细评估，并研究了SCN9A突变对细胞模型和躯体感觉系统的影响。NaV1.7功能丧失而引起的感觉障碍不仅与疼痛有关，并且CIP病人表现出温度辨别和瘙痒方面的缺陷。NaV1.7在人iPSC伤害性感受器神经元上表达并被运输到细胞膜表面、轴突和末端，并且在调节神经元兴奋性（尤其是在响应缓慢去极化刺激时）中发挥了关键作用。这些细胞模型中测试的NaV1.7阻断剂能够将人iPSC伤害性感受器神经元的兴奋性改变为类似于NaV1.7 KO的水平。但需要提醒的是，在某些情况下，有些药物对NaV1.7缺乏选择性。最后，在具有双等位基因SCN9A突变的人中，发现其体内伤害性感受器神经元的结构和功能均有严重缺陷。这可能源于NaV1.7功能的长期丧失。提示对人类来说，NaV1.7的急性药理学抑制作用可能无法完全复制CIP病人的无痛表型。