二甲双胍对间充质干细胞促成骨作用的研究进展*

钟梦伊 李 潇

骨折在人们日常生活中常常发生，特别是在人口老龄化的国家中，对骨折的发生及治疗所带来的问题日益突出。骨折风险的提高与各种代谢疾病有关，例如糖尿病、肥胖症和骨质疏松症等[1]。在世界范围内，2 型糖尿病(T2DM)的发病率正在迅速上升，并已被视为是全球公共卫生突发问题。据国际糖尿病联合会(IDF)预测，患病人数将会从2015年的4 亿1500 万上升到2040 年的6 亿4200 万[2]。而具体到口腔医学领域中，糖尿病已被证实为牙周炎的重要促进因素[3]。骨折满意的预后依赖理想的骨再生修复，牙周炎的治疗同样涉及到骨再生修复。二甲双胍(metformin，Met)是一种亲水性双胍类药物，从1998 年以来Lancet 杂志建议作为2 型糖尿病患者的一线药物而逐渐被广泛认可[4]。许多研究显示Met 的应用可降低该类患者发生骨折的风险[5，6]，最近的一项回顾性研究及meta 分析进一步验证了这一结论[7]。那么这些研究的背后是否提示Met 具有成为良好的促骨修复药物的潜能？因此，下文将对Met 促进成骨相关研究作一综述。

1.二甲双胍与AMPK

Met 是一种带正电荷的小分子药物，作为AMPK的一种经典激动剂，其主要通过活化AMPK 而发挥生理作用已得到共识[8]。AMPK 是一种细胞内感受器，其功能包括调控细胞内的能量和物质进出，在骨代谢中有重要作用。研究证明，Met 经细胞膜有机阳离子转运蛋白(Cell Membrane Organic Cation Transporters，OCT)进入细胞后主要作用于线粒体，通过抑制线粒体呼吸链复合物1，从而导致细胞内的磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)/ 三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)比例升高，变构激活AMPK[9，10]。

2.二甲双胍具有直接促进成骨作用

Met 作为2 型糖尿病患者的一线治疗药物被广泛应用后，其在降低该类型患者发生骨折的风险方面表现出优秀的潜能[5，6]，在骨再生修复领域备受关注。许多研究认为Met 主要通过激活AMPK 通路来促进成骨样细胞及MSCs 的成骨向分化；部分学者认为Met 还可磷酸化ERK，刺激e/ iNOS，或抑制GSK3β/ Wnt/ β-catenin 通路，进而促进成骨细胞的成骨分化，这些研究共同表明Met 具有直接的促成骨作用。此外，Met 还可抑制炎症因子的释放以及抑制脂肪生成，对骨组织具有保护作用，表明Met 可以间接地促进成骨。

2.1 二甲双胍经AMPK 信号通路直接促进成骨 骨愈合的过程与动员各种细胞群迁移至骨缺损部位有关，其中间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)具有支持造血、调节炎症反应、促进组织再生等功能，在修复骨缺损中发挥这关键作用[11]。多项细胞及动物实验先后证实了Met 具有直接促成骨作用，但作用机制众说纷纭，迄今，较多学者认为Met 主要经AMPK 促成骨细胞及MSCs成骨分化。Molinuevo 等[12]在一系列研究中，证明了Met 可促进前成骨细胞系(小鼠MC3T3-E1 及大鼠UMR-106)和大鼠来源的骨髓祖细胞(bone marrowprogenitor cells，BMPCs)的骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)的表达，增加碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性和I 型胶原的生成，表明Met 具有促进细胞增殖、成骨分化的生物学特性，验证了Cortizo等[13]的实验现象；在后续的成骨机制探讨中，Molinuevo 等[14]证明了Met 经激活AMPK 通路和成骨细胞特异性转录因子Runt 相关转录因子2/ 核心结合因子1(Runt-Related Transcription Factor 2/ core binding factor a1，Runx2/ Cbfa1)的表达，从而介导BMPCs 成骨分化[5]，并在动物实验中发现Met 可促进骨缺损修复。

值得注意的是，近年来Agnieszka 等[15]用不同的细胞系进行体外研究时，得到相似促成骨结论。Agnieszka 等[15]发现Met 通过活化大鼠脂肪组织来源的MSCs 的AMPK，促进成骨向分化，其上调AMPK 活性水平与经典AMPK 激动剂AICAR 的作用相似；而在大鼠双侧颅骨缺损模型中，进一步观察到Met 组的新生骨量和骨体积均显著高于对照组。Wang 等[15]利用浓度为10μM 的Met 处理与磷酸钙骨水泥支架(calcium phosphate cement，CPC)共培养的人类诱导多能干细胞衍生的间充质干细胞(induced pluripotent stem cells-derived MSCs，iPSC-MSCs)时，发现可显著诱导iPSC-MSCs 成骨分化，Agnieszka[15]、Wang 等[16]的机制研究再次提示：Met 是通过激活AMPK 信号通路从而直接促进成骨进程，且Met 的促成骨作用不局限于成骨样细胞。

具体到口腔医学，Met 也备受关注，特别是在牙周病治疗的领域中。Pradeep 等[17]在牙周治疗后患者的牙周袋内局部涂敷Met 凝胶发现，与对照组相比涂敷组的患牙附着丧失最小，探诊深度最低，提示Met 具有促进牙周骨组织再生的潜能。Pradeep[18，19]课题组的后续研究结果表明1%Met 凝胶可以显着诱导慢性牙周炎患者的骨再生。最近，几位学者的体外研究也显示了Met 对牙周病治疗的潜能，并展现出Met 具有优秀的骨组织工程应用前景。Yang[20]等将Met 联合聚多巴胺模板化羟基磷灰石支架(Polydopamine-templated hydroxyapatite，tHA)处理人牙周膜干细胞(Human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)，发现Met 可通过增加磷酸化AMPK 的表达促hPDLSCs 增殖和成骨分化。而Zhao 等[20]利用hPDLSCs 在CPC 支架上的体外种植实验同样表明了的Met 优秀的直接促成骨性能。Zhang[22]、Kuang 等[23]的实验共同表明Met 能显著上调hPSLSCs 的ALP、骨钙素、骨桥蛋白、Runx2 等成骨标志物的基因表达水平及蛋白表达，这些研究都提示Met 具有成为牙周组织再生辅助药物的潜能。

综上学者的研究可知，这些细胞及临床实验都提示了Met 在颌骨缺损修复及牙周组织再生领域方面有着广阔的研究前景。

2.2 二甲双胍经其他通路直接促进成骨 尽管许多研究强调AMPK 在成骨分化过程中的重要作用，但是亦有部分学者的研究显示Met 可经其他通路直接调控细胞成骨。如最初发现Met 对成骨细胞具有直接促成骨作用的Cortizo 等[13]，他们于2006 年研究Met(25～500μM)对两种成骨样细胞的影响，首次发现Met 具有直接促成骨细胞分化作用的同时，在机制探索上，认为Met 通过诱导磷酸化ERK 的活化和重分布，并呈剂量依赖性地刺激e/ iNOS 的表达从而促进成骨。此外，Met 还可调控AMPK 和丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine-specific protein kinase，AKT)通路之间的交通。Pantovic 等[24]的研究发现，AKT 和AMPK的活性呈负相关，活化的AMPK 可通过激活AKT/ mTOR 信号通路来促进人骨髓间充质干细胞(Human Bone mesenchymal stem cells，hBMSCs)的成骨分化。Ma 等[25]的研究发现，Met 通过抑制GSK3β/ Wnt/ β-catenin 通路促进hBMSC 的成骨分化。Met 促成骨研究的多样性表明了其研究前景的广阔。

3.二甲双胍间接促进成骨

骨修复是一个复杂且精密的过程，与机体内的其他进程密切相关，包括高胰岛素血症、炎症产物的沉积以及脂代谢紊乱等在内的过程，都会间接地影响细胞成骨分化及骨缺损的修复[26]。

3.1 抑制炎症因子的释放 在骨损伤修复初期，炎性的发生可阻碍细胞的成骨分化及骨组织再生。在炎症过程中，转录因子NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)的磷酸化可减弱成骨细胞的功能，造成细胞损伤和骨基质成熟的延迟；而抑制NF-κB 磷酸化则可增加抗炎因子白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-8(IL-8)的释放[27]。Mai[28]、Son[29]等的研究发现，Met 可通过调节成骨细胞内细胞因子的释放，促进骨保护素的分泌，并降低NF-κB 的表达，从而抑制破骨细胞的分化途径，进而间接促进成骨。最近，Mu 等[30]发现Met 在高糖条件下可促进小鼠前成骨细胞的增殖和分化，并且在体外高糖条件下Met 增加沉默信息调节因子2 同源蛋白6(silent mating type information regulation 2 homolog 6，SIRT6)的 表 达，抑 制NF-κB 的磷酸化，并且下调OCT4，从而促进成骨分化，而该课题组在SIRT6 基因敲除小鼠的动物实验，进一步验证了Met 抑炎促成骨的作用。

3.2 调控脂代谢，抑制成脂分化 骨代谢调控除了与干细胞的成骨向分化以及炎症因子的水平相关以外，其和脂代谢也有着密切的联系。因为BMSCs 可分化为骨代谢中的成骨细胞和脂代谢中的脂肪细胞，当两者的平衡被打破时，会导致骨代谢相关疾病[31]。

AMPK 除了在成骨过程中发挥重要作用之外，亦是脂代谢途径的关键酶之一。Luo 等[32]发现Met对骨组织的保护作用与其抑制脂肪生成的作用有关。接着，Wang 等[33]研究发现Met 通过AMPK/Gfi1/ OPN 信号通路，抑制脂肪生成从而刺激MC3T3-E1 细胞成骨分化。近年来，Chava 等[34]的研究表明，Met 可通过稳定Runx2 来抑制糖尿病诱导的骨脂肪生成，并且该研究结果首次表明成骨相关标志物Runx2 是AMPK 和Runx2-s118 磷酸化的新底物，而应激诱导的Runx2 降解程度取决于AMPK 的活性水平。这些的研究表明：Met 可调控脂代谢的活动进程从而间接促进细胞成骨分化。

4.展望

如何修复牙周炎所致的骨缺损，俨然已成为口腔临床医学中的一大难题，一直以来缺乏良好的辅助治疗药物。Met 具有良好的生物安全性，价格相对低廉以及降糖效果良好，已经多年被广泛临床使用。然而，近年来研究发现它的作用不仅仅局限于降糖，已有的临床和实验研究表明Met 具有优秀的促成骨性能，有望成为应用于牙周组织再生、颌骨缺损修复等骨组织工程领域的新型促成骨药物。尽管越来越多的学者已经关注Met 并取得一定成骨，但对于Met 的临床应用研究则仍处于起步阶段，这意味着Met 在该领域中仍有广阔的研究前景。随着国内外研究环境的持续发展、研究内容的不断深入以及研究技术的更新进步，未来有望完全阐明Met 的具体促成骨机制，使其在骨缺损修复及牙周组织再生领域中得到广泛应用。