MUC1在非小细胞肺癌诊断、预后及免疫治疗中的研究进展

李 萌 刘馨玉 石璞玉 陈明伟

肺癌是世界范围内发病率及病死率最高的恶性肿瘤，也是引发全球男性癌症相关死亡的首要原因，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)约占85%[1-2]。肺癌早期诊断困难、治疗效果差、生存率低。虽然晚期肺癌患者有望从姑息性放化疗中获益，但远期疗效仍不理想。新型靶向治疗已广泛应用于肺癌的各线治疗，但其只针对于特定基因突变群体，且初治有效的患者后期都将不可避免地出现耐药[3]。因此肺癌的治疗方案需进一步优化并与新的治疗方案结合以改善晚期患者的预后。黏蛋白-1(mucin 1, MUC1)是一种高度糖基化蛋白，在NSCLC患者中异常表达并参与肿瘤的发生、转移及增殖，这些特性使其成为一种重要肿瘤标志物及免疫靶点。本文对MUC1在NSCLC早期诊断、预后评估及免疫治疗的国内外研究进展作一综述。

一、MUC1的概述

1. MUC1结构及功能： 黏蛋白(mucins)是一种高度糖基化蛋白质家族，表达于多种器官的上皮细胞，其胞外区域含有由大量丝、苏氨酸和脯氨酸组成的串联重复序列，使其区别于其他糖蛋白，依据功能可分膜相关mucins和分泌相关mucins。MUC1是膜相关Mucins的一员，其结构为一种单通道Ⅰ型跨膜糖蛋白，MUC1多肽在翻译后自发性水解为两种肽片段，较长N-末端亚基(MUC1-N)及较短C-末端亚基(MUC1-C)[4-5]。其中，MUC1-N含有黏蛋白的核心部分，该核心部分由20～120个可变数目的串联重复序列构成(various number of tandem repeat, VNTR)。每个VNTR包含20个可被高度O-糖基化的氨基酸，VNTR区域的氨基酸序列在不同肿瘤细胞系中存在差异[6]。正常情况下，MUC1主要表达于上皮细胞及其分泌的黏液中，在黏膜保护、润滑以及局部天然免疫等方面发挥着重要作用[7-9]。而在恶性肿瘤中，MUC1的结构和生化特性发生改变，研究发现MUC1在肺癌中高表达，并参与肿瘤的发生、增殖、转移及耐药[10-13]，可作为识别和监测肺癌进展的适宜生物标志物[14-16]。

2. MUC1在肿瘤进展中的作用： 肿瘤细胞表达的MUC1被称为肿瘤相关性MUC1或低糖基化MUC1。正常细胞中MUC1的抗原表位被高度糖基化的分支糖链所覆盖，保护其不被蛋白酶分解[17]。MUC1的异常糖基化不仅可使其抗原表位暴露，还可激活NF-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)家族，增加白介素6(interleukin-6, IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)等炎症因子的转录及表达，趋化炎细胞聚集，进一步促进肿瘤及炎症的进展[18]。

肿瘤细胞间粘附性降低、循环肿瘤细胞粘附于远处器官血管内皮是肿瘤转移的关键步骤。Kalluri等[19]发现MUC1在β-连环蛋白(β-catenin)的作用下转移至细胞核，抑制E-粘连蛋白(E-cadherin)表达，并上调上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)诱导因子表达，使细胞间粘着连接处发生细胞骨架不稳定重排，降低癌细胞间的粘附，促进基底膜的侵袭。MUC1还可通过与半乳糖凝集素(galectin-3)结合促进细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases, ERK1/2)和蛋白激酶B(protein kinase B, AktB)的磷酸化，增强癌细胞对血管内皮细胞的粘附性和肿瘤的侵袭性[20]。此外，MUC1还可介导结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factors, PDGF)的产生，参与STAT3(signal transducers and activators of transcription, STAT3)、PI3K(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase, PI3K)及NF-κB通路的激活[13, 20-23]，并通过β-catenin/TCF4介导的机制激活MYC癌基因，增强肿瘤细胞的增殖及存活能力，促进肿瘤的发生发展[24]。

二、MUC1在NSCLC早期诊断及预后评估中的作用

付红艳等[25]发现肺鳞癌和肺腺癌患者血及癌组织中MUC1表达水平均升高。其中血MUC1用于诊断肺鳞癌和肺腺癌的敏感度分别为52.94%和61.54%，特异度分别为100%和95%。蒋平平等[26]研究发现NSCLC患者外周血中MUC1 mRNA水平在直径较大、分化程度低、晚期转移肺癌患者中升高尤为显著，其用于诊断NSCLC的灵敏度为68.8%，特异度为94.4%，MUC1 mRNA联合cyfra21-1可进一步提高NSCLC诊断的灵敏度(87.5%)。Meta分析显示MUC1的表达不仅对上皮源性肿瘤尤其是NSCLC及胃癌患者的预后具有指导意义还可作为NSCLC术后复发的监测指标[27-28]。Huang 等[29]研究发现MUC1过表达对手术和非手术治疗的NSCLC患者的总生存期(overall survival, OS)和无进展生存期(progression-free-survival, PFS)有显著的影响，MUC1高表达提示预后不良。

三、MUC1在NSCLC免疫治疗中的进展

免疫逃逸是肿瘤赖以生存的重要基础。肿瘤免疫治疗是指通过重启并维持肿瘤-免疫循环，恢复正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法，包括免疫检查点抑制剂、治疗性抗体、肿瘤疫苗等。有证据表明，肿瘤疫苗可提高癌症患者的远期生存率和生活质量[30-31]。NSCLC是著名的低免疫原性肿瘤，由于多种原因导致免疫反应无法触发，这种特性限制了免疫疗法在NSCLC中的发展。研究发现，MUC1的低糖基化可暴露肿瘤抗原表位，下调MUC1可抑制肿瘤细胞增殖和转移，并促进癌细胞凋亡[16]。目前，已有两种MUC1疫苗(TG4010和L-BLP25)在临床试验中显示出优势。

1. TG4010： TG4010是一种能够编码MUC1肿瘤相关抗原和白介素2(interleukin-2, IL-2)的重组修饰牛痘病毒悬浊液，旨在针对MUC1阳性的肿瘤，目的是诱导或放大针对表达MUC1肿瘤的细胞免疫反应[31]。Rochlitz等[32]通过为13例不同实体瘤患者接种TG4010发现转移性肿瘤患者对疫苗耐受性普遍较好，不良反应主要为注射部位的疼痛和流感样症状。在13例可评价的患者中，4例患者病情稳定6～9个月。在5例患者中发现了T细胞增殖免疫反应。该试验证明了TG4010在肿瘤患者中的安全性及耐受性，预示开展下一步临床研究的必要性。

(1)TG4010联合化疗： 紫杉醇(paclitaxel, PTX)作为一种细胞毒性药物已广泛用于NSCLC的治疗中。Ham等[10]发现PTX的耐药与肿瘤细胞MUC1的表达有关。与NSCLC A549细胞相比，耐PTX的A549细胞(A549/PTX)不仅成球能力增强，MUC1-C、PI3K/P-Akt及β-catenin等肿瘤相关蛋白也显著升高，沉默MUC1可使肿瘤细胞(A549/PTX)的PI3K/p-Akt表达减少并抑制干细胞成球能力，提示联合免疫治疗可能是增强化疗治疗效果、减缓耐药的一大捷径。一项评估TG4010联合一线化疗治疗晚期NSCLC的ⅡB期临床试验(NCT00415818)发现，TG4010联合化疗组与单独化疗组相比6个月PFS人数所占比例分别为43.2%及35.1%[33]。这项研究表明TG4010可增强晚期NSCLC化疗的效果，在此基础上已经开始筹备ⅡB/ⅢA期试验。

由Quoix团队开展的一项随机、双盲、安慰剂对照的ⅡB/Ⅲ期临床研究(TIME研究 NCT01383148)探索了TG4010治疗晚期NSCLC的疗效[34]。结果显示，在晚期NSCLC一线标准化疗方案中加入TG4010可显著改善患者的PFS(5.9个月vs. 5.1个月；P=0.019)，尤以CD16、CD56、CD69三阳性活化淋巴细胞(tripositive activated lymphocytes, TrPAL)小于或等正常上限值(upper limit of normal, ULN)的人群更为显著。在TrPAL值≤Q3亚组中，化疗联合TG4010也能显著改善OS(5.8个月vs. 5.0个月；P=0.010)，提示TrPAL可作为生物标志物预测TG4010在NSCLC化疗中获益的潜力，但其确切阈值尚未确定。因为主要的终点被满足，试验将继续进入第三阶段(TIME3期试验)进一步探讨TG4010结合化疗及免疫靶点抑制剂治疗NSCLC的疗效。

(2)TG4010联合PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂： 联合疗法的有效性及安全性在既往研究中已得到了证实[35]。一项旨在评估TG4010联合化疗在NSCLC中的疗效的安慰剂对照的随机二期临床研究显示，TG4010治疗后生存率的提高与T细胞对MUC1的反应相关，患者接受TG4010并获得MUC1相关免疫应答可增强机体对疫苗诱导肿瘤相关抗原(tumor related antigen, TAA)的免疫反应，这与针对TAA的CD8+T细胞免疫反应扩大有关[36]。这项结果证实了特异性T细胞免疫反应与生存率之间的因果关系，疫苗诱导的抗原表位扩散到其他TAA丰富了抗肿瘤免疫反应的多样性，TG4010作为一种有效的治疗选择可与其他靶向免疫调节剂联合，使反应效率和临床效益最大化。

程序性死亡受体1/程序性死亡配体1(programmed death-1/programmed death-ligand 1, PD-1/PD-L1)免疫检查点抑制剂是肺癌研究中的热点[37]，目前国内首个PD-1抑制剂纳武利尤单抗已被批准上市。TG4010联合PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂被认为是增强肿瘤特异性CD8+T细胞比例和激活细胞毒效应的一种有效策略[38]。Reck等研究发现[39]，接受TG4010序贯PD-1/PD-L1治疗的小鼠存活时间显著延长，且死亡风险较低。这些数据反映了序贯免疫治疗的优越性。目前一项评估TG4010联合Nivolumab(一种抗PD-1单克隆抗体)用于晚期NSCLC治疗的临床研究(NCT02823990)正在进行中。

Liu C等[40]构建了一种MUC1与存活素(MUC1 and surviving, MS)的联合基因肿瘤疫苗，其表达MS且与可溶性PD-1(soluble PD-1, sPD1)融合，称为sPD1/MS融合疫苗。在小鼠结直肠癌模型中，sPD1/MS疫苗使肿瘤抑制率从17.18%提高到30.96%，使生存率从6.96%提高到19.44%。在小鼠肺癌模型中发现此疫苗可使肿瘤浸润CD8+T细胞增加6.5倍，证实该疫苗通过激活淋巴细胞而表现出良好的免疫原性和抗肿瘤活性，这为融合性免疫治疗的下一步发展提供依据。

2. BLP25： BLP25 脂质体疫苗(L-BLP25，又称Tecemotide)是以抗MUC1和IL-2 基因所构建的肺癌疫苗，其可刺激免疫系统产生一种针对MUC1的特异性细胞毒性T淋巴细胞反应[41-42]。早期动物实验发现，用含有MUC1 VNTR的肽段联合佐剂免疫小鼠后可引起强烈的特异性迟发型超敏反应，并可抑制表达MUC1的小鼠胸腺瘤生长，延长荷瘤小鼠的生存期[43]。后续研究证实L-BLP25可以诱导以抗原特异性T细胞增殖和以IFN-γ产生为特征的细胞免疫应答[44]。基于以上背景开展了L -BLP25相关临床试验，以评估其安全性和有效性。

Palmer等[45]的Ⅰ期临床研究发现BLP-25在肺癌患者中耐受性良好，并可诱导T细胞免疫反应，晚期NSCLC患者接受不同剂量(200 μgvs. 20 μg)BLP25后的生存率变化(14.6月vs. 5.4月)促进了后续II期临床研究。随后在日本NSCLC患者中实施的一项非随机Ⅰ期研究及双盲、随机、安慰剂对照Ⅱ期研究显示L-BLP25在日本患者中也具有良好的耐受性及安全性，与之前研究结果一致[46]。

(1)L-BLP25联合最佳支持治疗： Butts等[47]在一线放化疗后疾病达到稳定的ⅢB/Ⅳ期NSCLC患者中进行了一项非盲、随机ⅡB期临床试验，旨在评估L-BLP25对晚期NSCLC患者生存率及毒性的影响。该研究共招募171名患者，入组患者在接受标准的一线化疗后随机分为L-BLP25联合最佳支持治疗(best supportive care, BSC)组和单纯BSC治疗组。结果显示，L-BLP25组的中位生存时间(median overall survival, mOS)比BSC组长4.4个月，研究中未观察到明显的毒性反应。该研究表明，对于晚期NSCLC患者，L-BLP25在保持较小毒性的同时作为维持治疗是可行的。

(2)L-BLP25联合放化疗： 为证实MUC1抗原特异性肿瘤免疫治疗在放化疗后的维持治疗中能否提高晚期NSCLC患者的生存率，Charles Butts团队在已接受放化疗且病灶无法切除的Ⅲ期NSCLC患者中开展了一项国际性、随机、双盲Ⅲ期临床试验(NCT00409188)[48]。入组患者按2︰1比例随机分配到Tecemotide组(829例)和安慰剂组(410例)，两组在接种疫苗前均予以环磷酰胺口服抑制T细胞反应，增强疫苗效果，此研究主要终点为OS。研究表明Tecemotide组与安慰剂组的mOS无统计学差异(25.3个月vs. 22.3个月；P=0.123)。亚组分析发现，在既往接受同步放化疗的患者中Tecemotide组的mOS显著延长(30.8个月vs. 20.6个月；P=0.016)，然而在序贯放化疗患者中两组的mOS并无差异(19.4个月vs. 24.6个月；P=0.38)。这提示对于所有不可切除的Ⅲ期NSCLC患者，放化疗后给予Tecemotide治疗与安慰剂相比，OS无显着差异。但是，Tecemotide可能对同步放化疗的患者起作用，因此有必要对该人群进行进一步研究。相关随机临床试验(NCT 0204915 START2项目)正在筹备中。然而一项研究发现即使在同步放化疗患者中，Tecemotide治疗NSCLC后的OS也没有明显增加(32.4个月vs. 32.2个月；P=0.83)，且未观察到3个次要疗效终点的改善[49]。因此，START2项目和Tecemotide未来的进一步发展遭到怀疑。

综上所述，NSCLC是目前最具挑战性的恶性肿瘤之一，无论在早期诊断及治疗方案上，仍有很大的发展空间。MUC1在NSCLC中高表达，并参与肺癌的发生发展，其作为一种新型肿瘤标志物在肺癌的早期诊断及预后评估中发挥重要作用。在传统的放化疗已达到瓶颈期时，免疫治疗作为一种新型疗法已经在众多肿瘤治疗中取得了显著的疗效，MUC1其也因独特的生化及功能特性而成为肺癌免疫治疗的新靶点。现今以MUC1为靶点的疫苗TG4010及BLP-25已在多项临床试验中证明了其安全性、耐受性及联合治疗有效性。目前MUC1相关疫苗的临床研究正处于Ⅲ期临床试验阶段，作为一个新起之秀，MUC1疫苗将以其特异性，长期性等优势有望在未来肺癌的综合治疗中进一步发挥其优势。