羊乳中牛乳成分的可视化环介导等温扩增检测方法

澹台玮，徐秦峰，张文娟，李艳妮

(陕西科技大学 食品与生物工程学院 国家羊乳制品加工技术研发专业中心，陕西 西安 710021)

0 引言

在我国，乳及其制品已成为人们日常营养的补充剂.并且随着生活水平的提高，对乳及其制品的需求逐渐由数量向质量转变，即人们更倾向于追求一些高营养价值的乳制品，如羊乳及其制品[1].但由于养殖和季节波动等影响，羊乳价格相对偏高[2].一些不法商家为了寻求商业利益，在羊乳中掺入牛乳，以次充好，且掺入手段多样，不仅损害了消费者合法权益，并对羊乳行业的健康发展产生了不利影响[3].由于传统感官检验及常规指标不易辨别，在2016年发布的农业行业标准《羊奶真实性鉴定技术规程》(NY/T3050-2016)中[4]，主要通过凝胶电泳、酶联免疫或PCR方法检测羊奶产品是否存在牛源性蛋白或者DNA，来鉴别羊奶产品是否掺入了牛源性奶成分.

相比于蛋白质，DNA对于热加工更为稳定[5]，并且由于PCR方法对目标DNA序列的指数扩增，PCR方法适用于生羊奶、UHT灭菌液态羊奶及羊奶粉中掺入牛源性奶成分的高灵敏检测.但是PCR方法需要热循环仪器和凝胶电泳观察实验结果，操作繁琐，无法实现羊奶真实性的现场快速检测，限制了此方法的推广应用.环介导等温扩增技术(Loop mediated isothermal amplification，LAMP)[6]则可实现在恒温条件下，特异、高效、快速地扩增核酸序列.LAMP反应无需热循环仪器，且LAMP产物可通过荧光目视可视化快速简单的鉴别[7].已有的LAMP荧光检测染料主要包括钙黄绿素、SYBR Green I等，普遍存在稳定性差、斯托克斯(stoke′s)位移小导致的颜色区分不明显等问题[8].

为了克服这种局限，本研究中发展了核酸分子“光开关”钌(II)配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+作为可视化LAMP荧光染料.[Ru(bpy)2(dppz)]2+在水溶液中本身不发光，DNA存在时荧光显著增强，具有优良的水溶性、稳定性、生物低毒性、Stoke′s位移大等优点[9-11].通过将金属钌配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+的核酸分子“光开关”特性与LAMP扩增反应结合，建立了羊乳中牛乳成分的可视化LAMP检测方法.该方法直接通过可视化荧光目视比色判定检测结果，具有快速、直观、低成本等优点，可为羊奶真实性现场快速检测提供技术支持，并可通过LAMP引物设计实现其它动植物源性食品的真实性快速检测.

1 材料与方法

1.1 实验材料

鲜牛乳样品采自西安市未央区草滩奶牛场，鲜羊乳样品采自陕西省西安市未央区市场，采集的鲜乳制品于-20℃保存备用.用于验证引物特异性的非目标DNA(鸡、猪、马、兔和鸽子)均购于四川华汉三创有限公司.不同品牌的羊乳产品(液态乳、羊奶片、全脂羊乳粉及配方奶粉)等样品分别购自西安市以及网上不同的超市，用于验证所建立方法的实际应用价值.

1.2 主要试剂和仪器

(1)试剂：磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒购自天根有限公司,甜菜碱(Sigma公司)，钌(II)配合物[Ru(bpy)2dppz]2+(Jena Bioscience公司)，dNTP混合液，Bst 2.0 WarmStarDNA聚合酶，MgSO4，均采自New England Biolabs.

(2)仪器：高速冷冻离心机(5424R，Eppendorf有限公司)；琼脂糖水平电泳仪(DYCP-31DN，北京六一生物科技有限公司)，电热恒温水槽(DK-8D，上海精宏实验设备有限公司)，超微量分光光度计(Q6000，美国Quawell)，蓝光透射仪(VE0100，SMOBIO).

1.3 DNA提取

根据实验室前期研究结果[12]，本实验中采用磁珠法提取新鲜乳品或羊奶制品中DNA，以超微量核酸定量仪测定DNA浓度和纯度后，将DNA溶液稀释到7 ng/μL，储存在-20 ℃，备用.

1.4 LAMP引物选取

本研究涉及的牛、羊特异性引物以线粒体保守序列为靶基因，选取SN/T 4419.21-2016标准中牛特异性引物及文献报道的羊特异性引物[13]，如表1所示.引物由上海生工生物有限公司合成.

表1 本实验中LAMP扩增引物序列

1.5 可视化LAMP方法建立及优化

LAMP反应体系为10μL，包括:1μL 10×Thermol Pol buffer，外引物F3和B3(10μM)各0.2μL，内引物FIP和BIP(40μM)各0.2μL，1.4μL dNTPs(10 mmol/L)，1.6μL甜菜碱(0.8 M)，0.4μL Bst DNA聚合酶(8 U/μL)，加入待测DNA 1.2μL，以双蒸水为空白对照，最后用水补齐到10μL，混匀.在64 ℃下恒温反应45 min.

反应结束后取1μL扩增产物加入50μL钌(II)配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+溶液，在蓝光透射仪下观察颜色变化,出现红色荧光为阳性，无色为阴性，同时结合2%的琼脂糖凝胶电泳分析鉴定.

为了确保颜色区分更明显，对镁离子浓度及钌(II)配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+染料浓度进行优化，其中镁离子浓度分别为2、4、6、8、10、12 mM，钌(II)配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+染料浓度分别为5μM、10μM、15μM、20μM、25μM.

1.6 可视化LAMP方法的特异性与灵敏度

以鸡、猪、马、兔、鸽子的基因组DNA分别作为待测样品模板，奶牛、山羊的乳基因组DNA分别作为模板阳性对照，双蒸水作为模板阴性对照(NTC)，按照优化好的条件进行LAMP扩增，反应结束后通过观察颜色变化，验证引物的特异性.

将7 ng/μL的奶牛和山羊DNA原液10倍浓度梯度稀释，浓度依次为：7 ng/μL、0.7 ng/μL、0.07 ng/μL、0.007 ng/μL、0.000 7 ng/μL、0.000 07 ng/μL、0.000 007 ng/μL，每个梯度均取1.2μL为模板，按照优化好的条件进行LAMP扩增，验证方法的灵敏度.

1.7 可视化LAMP方法的掺假比例检出限

为了验证所建立方法的灵敏度及适用性，在提取的羊乳DNA中掺入不同比例的奶牛乳DNA(比例依次为100%、80%、50%、10%、5%、1%、0.1%和0%)，取上述混合DNA 1.2μL为模板进行LAMP扩增，确定所建立方法的检出限.

1.8 市售样品的实际检测应用

使用优化好的可视化LAMP方法对市售羊乳样品进行检测，以验证建立方法的实用价值.

2 结果与讨论

2.1 可视化LAMP检测方法的建立

为了确定方法的可行性，在LAMP反应体系中设置有模板与空白对照进行扩增，反应结束后添加[Ru(bpy)2(dppz)]2+染料观察荧光颜色变化，并通过琼脂糖凝胶电泳和荧光光谱扫描进行确认.

实验结果如图1(b)中插图所示，在DNA模板存在时，能够观察到明显的荧光发射；而在没有DNA模板时，几乎观察不到任何的荧光发射.荧光目视比色与图1(a)中琼脂糖凝胶电泳结果一致，表明[Ru(bpy)2(dppz)]2+染料可用于LAMP扩增反应的检测.此外，在图1(b)中[Ru(bpy)2(dppz)]2+染料最大荧光发射处于红光波段,采用可见蓝光激发Stoke′s位移>150 nm，对比明显，目视比色更容易区分，可减小主观误差.

(a)电泳图(M：DNA Marker)(b)荧光光谱图(插图：颜色对比图;1:阳性对照;2:阴性对照)图1 可视化LAMP检测结果

2.2 可视化LAMP反应体系优化

为了建立最优的可视化LAMP检测体系，对镁离子浓度及钌(II)配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+染料浓度进行优化.镁离子浓度优化结果(如图2所示)显示，其浓度为8 mM时，显色反应最为明显.

同时，为了达到最佳的荧光目视比色效果，对钌(II)配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+染料浓度进行优化，结果(如图3所示)显示：当染料浓度大于10μM时即可达到较明显的阳性红色、阴性无色的颜色对比，基于节约试剂和检测效果稳定性考虑，选择15μM钌(II)配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+浓度作为后续试验的染料浓度.

图2 镁离子浓度的优化(1～6分别为2、4、6、8、10、12 mM镁离子浓度)

图3 钌(II)配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+染料浓度的优化(1～5分别为5、10、15、20、25 μM染料浓度)

2.3 特异性检测

采用牛、羊、鸡、猪、马、兔、鸽子等样品DNA为模板，进行LAMP反应，以验证引物的特异性，其结果如图4所示.针对牛、羊源性成分设计的特异性引物，仅含有目标成分DNA时观察到明显的颜色变红，即检测结果为阳性，空白对照和其他动物源性样品均未变色，为阴性结果，表明LAMP引物的特异性良好.

(a)牛源性成分(1～8分别为牛、羊、鸡、猪、马、兔、鸽子和空白对照)

(b)羊源性成分(1～8分别为羊、牛、鸡、猪、马、兔、鸽子和空白对照)图4 牛、羊源性成分LAMP引物特异性验证

2.4 灵敏度检测

为了确定建立的荧光目视比色方法能够检测到牛、羊乳DNA最低含量，将10倍梯度稀释的牛、羊源性成分DNA分别用于LAMP反应，其结果如图5所示.两种目标成分DNA检测可达到0.007 pg/μL和0.7pg/μL的检测限，表明基于钌(II)配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+染料的目视比色检测方法具有较高的检测灵敏度；颜色对比方面显示出红色和无色的明显区分效果.

(a)牛源性成分

(b)羊源性成分图5 牛、羊源性成分LAMP反应灵敏度检测(1～8为7、0.7、0.07、0.007、0.000 7、0.000 07、0.000 007 ng/μL DNA和空白对照)

2.5 检出限的确定

用可视化LAMP技术检测8种不同比例奶牛乳和羊乳DNA混合样品，结果(如图6所示)显示，在所有混合比例的样品中，该方法能检测出羊乳中掺假0.1%的牛乳，高于标准中PCR方法的2%检出限[4].

图6 羊乳中掺入不同比例牛乳的可视化LAMP检测(1～8分别为掺入牛乳DNA比例为100%、80%、50%、10%、5%、1%、0.1%、0%)

2.6 实际样品检测结果

为了验证方法的实用价值，选取市售不同品牌的全脂奶粉、脱脂奶粉、羊奶片及配方奶粉等13个羊奶样品，分别以奶牛、羊特异性引物对这些样品提取的DNA进行扩增.结果(如图7、表2所示)显示，标注为纯羊乳的样品(5、6、9)检测出牛乳成分，显示了在羊乳中掺入不同程度的牛乳成分；而样品13(标识有生羊乳、牛乳清粉)仅检测出牛乳成分，与标识的主成分不符.同时利用实时荧光LAMP及琼脂糖凝胶电泳进行对比验证，其结果与可视化LAMP结果一致，证明了该可视化LAMP方法可在实际检测中进行应用，且检测结果可靠.

(a)牛源性成分

(b)羊源性成分图7 市售羊乳制品中牛、羊源性成分检测结果(1:牛源性成分阳性对照；2：羊源性成分阳性对照；3～15为不同品牌的市售样品；16：空白对照)

表2 市售羊乳制品中牛、羊源性成分检测结果

注：“+”代表检测出该目标DNA；“-”代表未检测出目标DNA.

3 结论

根据线粒体保守序列选取牛、羊特异性引物，将金属钌配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+的核酸分子“光开关”特性与LAMP扩增反应相结合，建立了快速鉴别羊乳及其制品掺假牛乳的可视化LAMP检测方法.

结果表明，[Ru(bpy)2(dppz)]2+染料可用于LAMP扩增反应的荧光目视检测，并且其具有的大Stoke′s位移使得LAMP扩增DNA呈现红色荧光发射，与激发的蓝光对比明显，目视比色更容易区分.该方法具有良好的特异性和灵敏性，在混合样品中可检测羊乳中掺假0.1%牛乳，完全满足实际市场掺入量5%的检测需要[14]，并成功应用于市售样品的掺假检测.

相对于现有的基于其他荧光染料的可视化LAMP技术[15-17]，其节约了检测成本，操作简便，检测时限短，结果准确，而且克服了其他染料荧光目视比色时颜色对比不明显，以至可能无法区分其所对应的物种的缺点，更适用于大批量样品的快速掺假鉴别，可以作为乳品市场监督和检验鉴定的可行性方法.