肾上腺髓质素、受体活性调节蛋白2、3在膀胱癌的表达及意义

陈玉乐，杨文杰，吕 伟，刘天杰，李 磊

(西安交通大学第一附属医院泌尿外科，陕西西安 710061)

膀胱癌是人体泌尿系统常见恶性肿瘤之一[1]。肾上腺髓质素(adrenomedullin，AM)是降钙素基因肽超家族成员，参与了心血管疾病、炎症和肿瘤等多种疾病的发生发展[2]。受体活性调节蛋白(receptor activity modifying protein，RAMP)2和RAMP3在AM与其受体的结合中具有决定性的调控作用，是AM介导的信号传导及生物学功能的关键调节分子[2]。体外研究表明，AM可抑制膀胱癌细胞凋亡，并促进膀胱癌细胞生长、侵袭及迁移[3-4]。然而，AM及其下游信号关键蛋白在膀胱癌组织中的表达尚不明确。在本研究中，我们拟通过免疫组织化学染色方法探讨AM、RAMP2、RAMP3在膀胱癌中的表达和意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料AM和RAMP3抗体购自Abcam公司(Cambridge，UK)。RAMP2抗体购自Santa Cruz 公司(CA，USA)。EnVision免疫组织化学染色试剂盒购自DAKO 公司(CA，USA)。

1.2 膀胱癌组织标本人膀胱癌组织芯片购自上海芯超生物科技有限公司(货号：HBla-Uro105Sur-01)，包含59例膀胱移行细胞癌和46例癌旁尿路上皮组织。3张组织芯片分别用于AM、RAMP2、RAMP3的免疫组织化学染色。无尿路上皮组织或癌组织、染色过程中脱片或因有效组织太小影响结果判定者均被排除。11例标本因缺乏患者生存信息而被排除于生存分析之外。最终25例尿路上皮组织和58例膀胱癌组织被用于蛋白表达分析，47例膀胱癌组织被用于生存分析。本研究所采用的膀胱癌标本的临床和病理信息见表1。

表1 58例膀胱癌临床病理资料

项目例数(%)中位年龄(岁)68.4(44～85)临床分期 Tis5(5.9) T111(19.0) T217(29.3) T322(37.9) T43(5.2)项目例数(%)性别 男49(84.5) 女9(15.5)病理分级 G13(5.2) G232(55.2) G323(39.7)中位随访时间(月)34.1(3～82)

1.3 免疫组织化学染色及结果评估采用DAKO EnVisionTM +系统进行免疫组织化学染色。组织芯片经脱蜡、水化等处理后浸入柠檬酸缓冲液，于121 ℃抗原修复5 min。内源性过氧化物酶阻断15 min后滴加一抗(1∶150稀释)，4 ℃孵育12 h，随后用EnVision-HRP标记的二抗室温孵育30 min，并依次进行DAB显色、苏木素染色、盐酸分化、氨水返蓝等处理。梯度酒精溶液脱水和二甲苯透明后以中性树胶封片。染色结果评估按本实验室常用的综合染色强度与阳性细胞百分比的双重评分系统进行。由1位病理科医师在不知实验目的与患者信息的情况下进行，每例组织在高倍镜下随机挑取5个高倍视野进行评分。根据染色强度将结果分为无着色、弱着色、中等着色及强着色4类，分别得0、1、2、3分；根据阳性细胞百分比将结果分为-、<25%、25%～≤50%、>50%～≤75%、>75%共5类，分别得0、1、2、3、4分。将上述2种方法得分相乘得到介于0～12分之间的总得分，将总得分≥4分的组织定义为表达阳性。

1.4 统计学分析使用SPSS 18.0软件进行统计分析。采用Pearson卡方检验(T>5)或Yates’连续性校正卡方检验(T≤5)进行不同组别间蛋白表达差异分析，采用log-rank检验进行生存分析。P<0.05时为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 AM在膀胱癌组织中的表达通过对25例癌旁尿路上皮组织和58例膀胱移行细胞癌组织的免疫组织化学染色，观察到AM主要定位于尿路上皮细胞和膀胱癌细胞的细胞质中(图1A，红色箭头)。根据我们的评分标准，11例(44%)尿路上皮组织和23例(39.6%)膀胱癌组织被鉴定为AM阳性。统计分析显示癌旁尿路上皮组织和膀胱癌组之间无显着差异(P>0.05)。AM表达与患者年龄、性别、肿瘤分期、分级无关(表2)。生存分析显示AM+组和AM-组患者总生存期无明显差异(HR:0.68，95%CI:0.32～1.47，P=0.34，图1B)。此外，间质细胞中也有AM表达(图1A，蓝色箭头)，表明间质细胞也是肿瘤微环境中AM的重要来源。

图1 AM在膀胱癌和癌旁尿路上皮组织中的表达

A：AM在膀胱癌和癌旁尿路上皮组织中的表达(红色、蓝色箭头分别示肿瘤和间质细胞中的AM表达)；B：AM+和AM-组患者总生存期比较。

2.2 RAMP2在膀胱癌组织中的表达随后我们进行了RAMP2的免疫组织化学染色(图2A)。7例(28%)尿路上皮组织和32例(55.2%)膀胱癌组织被鉴定为RAMP2阳性。统计分析表明，两组间RAMP2表达具有显著性差异(P<0.05)。通过对不同分级肿瘤的比较发现，3级膀胱癌具有比1～2级膀胱癌更高的RAMP2表达水平的趋势(60.9%vs.51.4%)，但差异无统计学意义(表2，P>0.05)。此外，年龄<70岁的患者的RAMP2表达水平高于≥70岁的患者(表2，P<0.05)。不同性别、肿瘤分期患者RAMP2表达无明显差异(表2)。与RAMP2-的患者相比，RAMP2+的患者具有更短的总生存期(HR:2.73；95%CI:1.30～5.80；P<0.01，图2B)。

2.3 RAMP3在膀胱癌组织中的表达针对RAMP3的免疫组织化学染色(图2A)发现，19例(76%)尿路上皮组织和48例(82.8%)膀胱癌组织被鉴定为RAPM3阳性。统计分析表明癌旁尿路上皮组织与膀胱癌组之间RAMP3表达无显著差异(P>0.05)。RAMP3表达与患者年龄、性别及肿瘤分期、分级无关(表2)。此外，RAMP3-患者与RAMP3+患者的总生存期也无明显差异(HR:1.36；95%CI:0.51～3.45；P>0.05，图2C)。

图2 RAMPs在膀胱癌和癌旁尿路上皮组织中的表达

A:RAMP2和RAMP3的表达代表图；B:RAMP2+和RAMP2-组患者总生存期比较；C.RAMP3+和RAMP3-组患者总生存期比较。

表2 AM、RAMP2和RAMP3在膀胱癌的表达与临床病理特征的关系 [例(%)]

3 讨 论

AM是一种具有舒张血管、降低血压等多重活性的分泌性蛋白，因最初是从人肾上腺嗜铬细胞瘤中分离出来而得名[5]。肿瘤微环境中AM的来源及调控复杂多变。一方面，肿瘤细胞在发生发展过程中可获得较高的AM表达水平[6]；另一方面，多种间质细胞成分如血管内皮细胞、肥大细胞、巨噬细胞和成纤维细胞等均可产生AM[7]。此外，缺氧等条件也进一步诱导肿瘤细胞表达AM[8]。AM介导的bcl-2上调对于缺氧条件下骨肉瘤细胞的存活至关重要[9]。我们最近的研究表明，肾癌细胞产生的AM可通过肥大细胞促进血管形成[10]。有学者通过实时定量聚合酶链反应及Western blot实验初步检测了AM在人膀胱癌及癌旁正常组织的表达水平，发现AM在膀胱癌的表达高于癌旁组织，并与肿瘤分期正相关。在体外培养的膀胱癌细胞系，AM可被缺氧条件诱导表达，沉默AM表达可促进细胞凋亡并抑制肿瘤生长[4]。另一项研究表明，AM可促进膀胱癌和前列腺癌细胞的侵袭和迁移[3]。本研究中，我们通过免疫组织化学染色检测了AM在膀胱癌及癌旁尿路上皮组织的表达，相对于实时定量聚合酶链反应及Western blot，免疫组织化学染色可更直观地检测蛋白在组织及细胞的定位情况。与前人研究不同的是，我们并未发现AM在膀胱癌和尿路上皮组织之间的表达差异，亦未观察到AM与肿瘤分期有关。我们在膀胱癌细胞及膀胱癌间质细胞中均观察到AM表达，表明膀胱癌组织中AM来源的复杂性，也提示AM可能是膀胱癌细胞和间质细胞之间“对话”的重要介质。

降钙素受体样受体(calcitonin-receptor-like receptor，CRLR)隶属G蛋白偶联受体，是AM的主要受体[7]。CRLR与AM的结合受RAMPs调控。当CRLR与RAMP1结合时，形成降钙素受体而与降钙素结合。当CRLR与RAMP2或RAMP3结合时，形成AM受体，与AM结合并介导其生物学功能。因此，RAMPs可决定AM与CRLR的亲和力，是AM下游信号的重要调节蛋白[2]。研究表明，AM可通过CRLR/RAMP2、CRLR/RAMP3实现对血管内皮细胞增殖、迁移、分化和凋亡的调控。

然而，RAMP2与RAMP3的功能并不完全相同。CRLR/RAMP2只能被AM激活，而CRLR/RAMP3对AM和intermedin(也称为AM2)具有相同的亲和力，因而可以被这两种配体激活[2]。动物实验显示AM或RAMP2敲除小鼠由于血管异常而在子宫内死亡，但RAMP3敲除小鼠正常出生，且未被发现明显异常，表明CRLR/RAMP2和CRLR/RAMP3具有不同的功能[5]。在本研究中，我们发现与尿路上皮组织相比，RAMP2在膀胱癌组织中上调，并且与不良预后相关。然而，尿路上皮组织和膀胱癌组织都具有较强的RAMP3表达，且膀胱癌中的RAMP3表达对患者的存活无明显影响。由于RAMP2与CRLR形成特异性AM受体，因此我们推测RAMP2可能是膀胱癌中AM信号的下游关键调节蛋白。

综上所述，在本研究中我们发现AM广泛表达于膀胱癌细胞及膀胱癌间质细胞，表明肿瘤细胞和间质细胞均是膀胱癌微环境中AM的来源。RAMP2在膀胱癌组织高表达并与患者不良预后有关，提示RAMP2是膀胱癌中AM信号的关键调节蛋白，并可能参与了膀胱癌进展。后续研究将进一步通过体外实验和动物模型等来明确AM/CRLR/RAMP2信号在膀胱癌进展中的详细作用及分子机制。