创新型实验脂肪组织石蜡切片制作过程中常见问题分析

陈文婧，郝兴霞，张东泽

（内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特010021）

脂肪组织可以分成白色脂肪组织和棕色脂肪组织。人们通常所说的脂肪组织是指白色脂肪组织，新鲜时呈黄色，该脂肪细胞为圆形或卵圆形，细胞内含大的脂肪滴，主要分布于皮下组织、网膜和肠系膜等部位。

脂肪组织早期被人们认为是储存能量的器官。现如今，人类生活水平不断提高，由脂肪引起的一系列疾病也随之高发，人们逐渐意识到脂肪细胞的分化对脂肪细胞的结构和功能变化具有重大影响[1]。脂肪组织通过产生游离脂肪酸和炎性因子引起胰岛素抵抗、脂代谢异常、内皮功能障碍、血栓及动脉粥样硬化的发生[2]。在临床的病理诊断中，有很多富含脂肪组织（如乳腺组织）的病理切片，而切片质量的好坏直接影响了医生诊断的准确性。脂肪组织结构特殊，其常规石蜡切片大多结构不完整，组织破损甚至脱落，给镜下观察带来很多不便，直接影响了学生的学习和病理的诊断。因此脂肪组织被列为不易应用术中快速活检的范围[3]。基于此，本实验根据石蜡切片的常见问题，从取材、固定、脱水、透明、烤片、染色等步骤分析切片制作过程中的注意事项。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验材料

甲醛溶液、95%乙醇溶液、无水乙醇、二甲苯溶液，分析纯级别（天津市风船化学试剂科技有限公司）、Solarbio苏木精染液G1140500ml、Solarbio伊红染液G1100500ml、切片石蜡500 g（北京首医临床医学科技有限公司）、10004160中性树胶100g（国药集团化学试剂有限公司）

1.1.2 实验仪器

KEDEEKD-BMⅢ电脑生物组织包埋机（南京依贝仪器设备有限公司）；LeicaRM2235切片机、LeicaHi1220烤片机、LeicaHi1210捞片机均为Leica公司生产。

MoticB1SERIES显微镜，Motic公司生产

1.2 脂肪切片制作步骤

1.2.1 取材和固定

采用乙醚麻醉法处死大鼠，十字法解剖，取腹腔皮下和肠系膜处脂肪组织。放入10%的甲醛溶液中固定12h后，将组织修成1m3的小块，继续固定24h。

1.2.2 脱水、透明、浸蜡和包埋

固定后的脂肪组织放入包埋盒中用流水冲洗12h以上，取出放入梯度乙醇溶液中脱水（70%乙醇3h、80%乙醇3h、90%乙醇过夜、95%乙醇Ⅰ1.5h、95%乙醇Ⅱ1.5h、100%乙醇Ⅰ1.5h、100%乙醇Ⅱ1.5h）；脱水后脂肪组织放入二甲苯溶液中透明；透明后的脂肪组织放入包埋机中浸蜡包埋，蜡Ⅰ30min，蜡Ⅱ30min，蜡Ⅲ30min。

1.2.3 切片和染色

取包埋好的蜡块连续切片，切片厚度6μm。用免洗载玻片捞片、烤片后，进行HE染色。

2 常见问题分析

2.1 取材浪费

处死大鼠取脂肪组织制作脂肪组织切片时，如果不有效利用大鼠的其他组织器官，会造成对实验动物的浪费。因此取材时应尽量在其他老师、学生做实验的同时取用组织，或者在学生上大鼠解剖课程时取材，从而避免浪费。

2.2 固定不彻底

由于脂肪组织内含有大量的脂肪滴，密度较小，一般漂浮于固定液的上层，从而导致脂肪组织无法被彻底固定（如图1）。本实验采用10%的甲醛溶液对组织进行固定，组织在固定液中始终处于漂浮状态，因此在试验中要尽可能地延长固定时间，以免因脂肪组织固定不彻底而导致实验失败。

图1 脂肪组织在福尔马林固定液中漂浮

2.3 脱水时间的选择和分配

基于脂肪组织的特殊结构，应适当延长组织的脱水时间。在实验室没有购置组织脱水机的情况下，需要人工完成脱水过程，因此要合理设置脱水时间。既要保证脂肪组织在脱水剂中过夜，又要保证实验在合理的时间范围内完成，这是本实验中需要解决的一个重要问题。

2.4 透明时间的选择

脂肪组织和其他组织不同，如果透明时间不够，二甲苯不能完全进入脂肪细胞中，会影响组织的浸蜡，使得包埋后的组织会慢慢渗出脂肪滴，无法进行切片。

2.5 烤片温度的选择

脂肪组织在预热时容易融化，因此选择合适的烤片温度尤为重要。温度过高，组织因融化无法贴合于载玻片上；温度过低，石蜡不易融化，会在组织处产生很多小气泡，破坏组织结构，影响切片的质量。

2.6 染色后着色浅

如图2所示，脂肪细胞含大量脂肪滴，细胞核被挤在一侧，切片染色结果经常是大面积粉染结构，而苏木精染色细胞核着色较浅，不易观察，影响切片质量。为了得到染色效果较好的切片，应该适当延长组织在苏木精染液中的染色时间。

图2 HE染色后的脂肪组织，细胞核着色较浅

3 结论

石蜡切片是目前动物组织细胞制片的主要方法之一。与冰冻切片相比，采用石蜡切片方法除对抗原敏感性有影响外，在细胞形态清晰度、阳性反应物斑块显色及降低假阳性误断率等方面均占有优势[4]。在制作脂肪组织石蜡切片实验中，应做到节约动物实验材料，选择合适的脱水、透明、烤片、染色时间，从而提高切片质量，为今后的教学和临床工作提供方便。