两种技术对不同手术标本进行检测诊断胸壁结核的价值

任航空 段李明 郑琴芳

胸壁结核是胸外科的常见疾病，对此病的临床诊断除了手术标本的病理学检查之外，还包括对术后药物治疗有指导性的病原学检测。胸壁病灶的手术标本形态差异性较大，临床常见的手术标本包括脓液、干酪样坏死组织、肉芽组织。对GeneXpert MTB/RIF(简称“GeneXpert”)和BACTEC MGIT 960液体培养(简称“MGIT 960”)在体液的研究较多见[1-2]，但对其在胸壁手术标本的检测筛选却鲜有报道。本研究将GeneXpert和MGIT 960分别作为分子生物学和细菌学的典型代表应用于胸壁疾病的手术标本检测，研究两种技术对胸壁结核的诊断价值，同时筛选阳性率高的手术标本类型，以期指导临床有效利用卫生资源。

资料和方法

一、一般资料

搜集2016年6月至2019年7月西安市胸科医院外科收治的214例疑似胸壁结核患者的临床资料。214例患者中，男117例(54.7%)，女97例(45.3%)；年龄6～81岁，平均(45.8±17.5)岁。其中肋骨破坏114例(53.3%)，并发结核性胸膜炎42例(19.6%)，并发肺结核27例(12.6%)，并发脊柱结核8例(3.7%)，并发高血压25例(11.7%)，并发糖尿病13例(6.1%)。通过临床综合诊断、病理学检查确诊胸壁结核174例，非结核性胸壁疾病40例。将外科手术获取胸壁病灶中的脓液、干酪样坏死组织及肉芽组织标本分别取部分组织送病理学检查后，对3种类型手术标本同时进行GeneXpert和MGIT 960检测。

二、胸壁结核临床诊断标准

参考英国国家卫生与临床优化署2016年制定的结核病诊断指南中的关于肺外结核诊断的指导意见[3]，本研究临床诊断为胸壁结核的标准为：症状体征与影像学(包括B超、X线及CT检查)发现的局部结核病灶的脓肿、肋骨破坏相符；(2)病灶标本的病理学检查提示为干酪样坏死并朗格汉斯肉芽肿；(3)病灶标本的微生物学或分子生物学检查证实为结核分枝杆菌感染；(4)规律抗结核药物治疗6个月以上，结核毒性症状及局部症状消失。符合以上任意2条即诊断为胸壁结核。

三、标本的制备

手术过程中，以20 ml灭菌注射器抽取脓液，封装后快速送检，避免渗出血液污染脓液及生理盐水稀释脓液；留取干酪样坏死组织、肉芽组织于灭菌弯盘中，用生理盐水冲洗干净，封装于灭菌标本蓝盒中快速送检，避免脓液、干酪样坏死组织、肉芽组织混杂送检。共制备152份脓液标本、128份干酪样坏死组织标本、138份肉芽组织标本。对3种类型标本均进行GeneXpert和MGIT 960检测。

四、结核分枝杆菌实验室检测方法

1.标本处理：脓液标本依照《结核病诊断实验室检验规程》[4]，采用N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)-氢氧化钠法进行标本处理。 肉芽组织及干酪样坏死组织在加入适量磷酸盐缓冲液(PBS， pH 7.0)后，应用微型研磨器Fast-24(美国MP Biomeidcals公司)进行匀浆，之后直接接种或进行分子生物学检测。

2.GeneXpert检测：按照GeneXpert MTB/RIF操作说明进行。取1 ml经过上述第一步处理的标本于有螺旋盖的无菌管中，然后加入2 ml标本处理液，放置于涡旋振荡器上涡旋振荡10 s，室温静置10 min，重置于涡旋振荡器上振荡10 s，室温静置5 min，使标本充分液化。吸取2 ml液化标本至GeneXpert反应试剂盒，然后将反应试剂盒放置到检测模块，仪器开始进行自动化检测。反应完成后，在检测系统窗口下可直接查看测试结果。

3.MGIT 960培养：将肉芽组织或坏死组织匀浆后，使用NALC-氢氧化钠消化15 min,然后加入无菌PBS，3000×g离心15 min，将沉淀重新悬浮于2 ml的PBS中。将0.5 ml处理后标本接种在BACTEC MGIT 960分枝杆菌生长指示管，进行混匀，室温静置30 min。然后在37 ℃条件下放置在BACTEC MGIT 960仪器中进行孵育，最长时间为42 d，并定期进行监控。培养阳性标本经萋-尼抗酸染色确认，并进一步用MPB64单克隆抗体(杭州创新生物检控技术有限公司)进行检测，鉴定为结核分枝杆菌。脓液标本直接加消化液进行操作。以空白管作为阴性对照。

4.试剂：GeneXpert MTB/RIF试剂盒购自美国Cepheid公司， BACTEC MGIT 960含药培养基购自珠海市银科医学工程有限公司。

五、统计学处理

结 果

一、GeneXpert和MGIT 960对3种类型手术标本的检测结果

在152份脓液标本检测中，GeneXpert和MGIT 960检测结果均阳性47份，总的阳性份数为68份，阳性率44.7%；在128份干酪样坏死组织标本中，两种方法检测结果均阳性51份，总的阳性份数为88份，阳性率68.8%；在肉芽组织检测中，两种方法检测结果均阳性86份，总的阳性份数为113份,阳性率81.9%。将脓液、干酪样坏死组织、肉芽组织的检出阳性率两两比较，P值均<0.05。具体见表1。

二、以临床诊断结果为参考标准评价GeneXpert和MGIT 960两种方法的诊断效能

1.临床诊断：214例疑似胸壁结核患者通过术前血液化验、影像学资料及术后病理结果临床最终诊断为胸壁结核174例，非结核性胸壁疾病40例(其中化脓性胸壁脓肿18例，胸壁囊肿并发普通细菌感染9例，软组织肿瘤8例，肋骨骨髓炎3例，胸壁放线菌病2例)。

2.两种方法的诊断效能评价：本研究共收集疑似胸壁结核214例，GeneXpert对疑似胸壁结核的诊断鉴定结果显示有144例为阳性，70例为阴性。GeneXpert和临床诊断的共同阳性结果为143例，共同阴性结果为39例；以临床诊断结果为标准，GeneXpert鉴定胸壁结核的敏感度为82.18%(143/174)，特异度为97.50%(39/40)，阳性预测值为99.31%(143/144)，阴性预测值为55.71%(39/70)，Kappa值为0.618。MGIT 960培养对疑似胸壁结核的诊断鉴定结果显示有94例为阳性，采用对硝基苯甲酸(PNB)进行菌种鉴定，培养阳性的标本中有3例为非结核分枝杆菌(NTM)，因此，最终确认为培养阳性的结核分枝杆菌标本为91例，阴性样本为123例。MGIT 960和临床诊断的共同阳性结果为91例，共同阴性结果为40例；以临床诊断结果为标准，MGIT 960鉴定胸壁结核的敏感度为52.30%(91/174)，特异度为100.00%(40/40)，阳性预测值为100.00%(91/91)，阴性预测值为32.52%(40/123)，Kappa值为0.291。具体见表2。

表1 3种类型标本采用GeneXpert及MGIT 960的检测结果(阳性率差异)比较

注在脓液检测中，两种方法检测结果均阳性47份，MGIT 960培养阳性47份，GeneXpert检测阳性68份；在干酪样坏死组织中，两种方法检测结果均阳性51份，其中MGIT 960培养阳性53份，GeneXpert检测阳性86份；在肉芽组织检测中，两种方法检测结果均阳性86份，其中MGIT 960培养阳性89份，GeneXpert检测阳性110份。MGIT 960培养阳性者经菌种鉴定为结核分枝杆菌，非结核分枝杆菌已剔除。a:脓液与干酪样坏死组织2种标本检测结果之间的阳性率比较，通过Bonferroni方法校正P值，0.05/3=0.017，P<0.001<0.017。b:干酪样坏死组织和肉芽组织2种标本检测结果之间的阳性率比较，P=0.013<0.017。c:肉芽组织和脓液2种标本检测结果之间的阳性率比较，P<0.001<0.017

表2 GeneXpert与MGIT 960以临床诊断为参考标准检测胸壁结核的效能

注敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%=a/(a+c)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%=d/(b+d)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%=a/(a+b)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%=d/(c+d)×100%

GeneXpert检测胸壁结核的曲线下面积(AUC)值为0.898， 95%的置信区间(95%CI值)为0.853～0.944；MGIT 960检测胸壁结核的AUC值为0.761，95%CI值为0.697～0.826，GeneXpert的诊断价值高于MGIT 960(图1)。

讨 论

一、GeneXpert与MGIT 960对胸壁结核不同形态类型病灶标本检测阳性率的比较

GeneXpert与MGIT 960是目前临床上常用的检测方法，在获得病原学依据及判断结核分枝杆菌是否耐药方面起着重要作用。脓液标本容易获得，但脓液中的结核分枝杆菌培养阳性率较低[5]；而肉芽组织的结核分枝杆菌培养阳性率高于脓液，但总体的病原学阳性检出率仍不高，仅为36.8%[6]。而唐亮等[7]应用GeneXpert和细菌培养法对脊柱结核的不同类型病灶的检测结果显示，脓液阳性率较高[(73.02±6.33) %；(44.44±7.08) %]，肉芽组织次之[(73.02±6.33) %；(43.86±7.44) %]，干酪坏死物最低[(39.87±7.76) %；(30.72±7.31) %]，GeneXpert的检测阳性率明显高于细菌培养。林庆玺等[8]用聚合酶链式反应(PCR)法检测活动性关节结核不同的病理材料，结果为肉芽组织的阳性率为74.42%(32/43)，明显高于干酪样坏死组织[58.14%(25/43)]和脓液[37.21%(16/43)]。本研究显示，GeneXpert联合MGIT 960检测3种类型胸壁结核病灶标本，肉芽组织的阳性率为[81.9%(113/138)]，明显高于干酪样坏死组织[68.8%(88/128)]和脓液[44.7%(68/152)]。脓液与干酪样坏死组织两组之间的阳性率比较，通过Bonferroni方法校正P值，P<0.017，干酪样坏死组织和肉芽组织两组之间的阳性率比较，P=0.013<0.017，肉芽组织和脓液两组之间的阳性率比较，P<0.017；表明2种方法对肉芽组织检测阳性率明显高于脓液和干酪样坏死组织，差异均有统计学意义。与林庆玺等[8]单用PCR检测活动性关节结核不同病理材料的研究结果一致。因此，术中留取标本的过程中，肉芽组织应作为首选的检测材料。为了节约医疗资源，可联合GeneXpert与MGIT 960仅对肉芽组织进行检测，以获得更优的检测结果。

二、GeneXpert与MGIT 960检测诊断胸壁结核的效能分析

GeneXpert检测可最短在手术标本送检后2 h获得结果，能够对胸壁结核进行早期诊断。GeneXpert检测过程在全自动全封闭的状态下进行，能够有效避免标本处理过程中的污染问题，单从操作技术层面考虑，GeneXpert便捷、自动化、准确的优势更宜在外科手术标本检测中应用。本研究纳入的疑似胸壁结核患者中，从术后普通细菌培养及病理结果来看，普通细菌感染占非结核性胸壁疾病的67.50%(27/40),其中包括化脓性胸壁脓肿18例，胸壁囊肿并发普通细菌感染9例，值得在外科工作中引起警惕。在诊断胸壁结核方面，GeneXpert的敏感度和特异度分别为82.18%和97.50%，与国内近4年的骨关节结核研究结果基本一致[9-11]。本研究中，GeneXpert鉴定胸壁结核的结果与临床诊断结果的一致性较好(Kappa=0.618)，而MGIT 960鉴定胸壁结核的结果与临床诊断结果的一致性较差(Kappa=0.291)，表明GeneXpert对疑似胸壁结核手术标本的检测效能高于MGIT 960。本研究结果与范国萍等[12]对可疑肺结核痰液标本的研究结果一致；而MGIT 960对送检标本的检测时间较长，需要14～40 d不等。与GeneXpert相比，MGIT 960检测的敏感度仅为52.30%，原因可能如下：一方面因为MGIT 960液体培养时只检测标本中的活菌；而GeneXpert检测的是结核分枝杆菌的DNA片段，即使为死菌，也可获得阳性检测结果；另一方面，可能与实验操作人员的操作规范、操作污染等因素有关[13-14]。MGIT 960的优点是可以对检测阳性标本进一步做一线、二线抗结核药物的药物敏感性试验，从而较全面地判断耐药情况，而GeneXpert仅能判断菌株对利福平是否耐药。

三、本研究的不足之处及展望

本研究对于干酪样坏死组织和肉芽组织仅凭肉眼分辨，后续如能筛选一些经济情况好的患者，对送检标本做一个病理学预判，研究所得结果将更具说服力。

综上所述，胸壁结核不同形态的病灶中，肉芽组织是获得病原学依据的重要标本形式；而检测方法上，GeneXpert与MGIT 960联合检测，能够提高手术标本阳性检出率，对胸壁结核的早期诊断及后续用药意义重大。