兔VX2骨肿瘤模型研究进展

吕家兴，白磊鹏 综述，金宇 审校

067000 河北 承德，承德医学院附属医院 创伤骨科

恶性骨肿瘤的特点是起病隐匿，恶性程度高，早期诊断率低，目前的治疗方式主要为手术及放化疗，由于大多数患者就诊时肿瘤已发生远处转移，远期生存率仍未有明显提高[1]。早期发现、正确诊断及治疗对恶性骨肿瘤的预后起关键作用。合适的动物肿瘤模型对于研究恶性骨肿瘤的生长、生物学特性及治疗效果有极为重要的价值。研究者们已将VX2肿瘤种植于兔骨骼中，制作成兔VX2骨肿瘤模型，发现该模型与人恶性骨肿瘤有相似的生物学特性，目前应用于人恶性骨肿瘤的检测、治疗及预后等领域的动物实验研究。本文通过对兔VX2骨肿瘤模型相关研究进展进行综述，总结兔VX2骨肿瘤模型的来源、生长特性，报道其制作方法及应用领域方面研究的新进展。

1 兔VX2骨肿瘤的来源及生长特性

1.1 兔VX2骨肿瘤来源

VX2肿瘤起源于shope病毒诱发兔外阴乳头状瘤衍生的鳞状细胞癌，经过72次移植传代后正式建立，由Rous等[2]在第四次国际癌症会议上报道后得到承认，并将其定义为一种可移植的恶性肿瘤[3]。VX2肿瘤生物学性质稳定,种植后增殖迅速,短期内即可发生远处转移。VX2肿瘤制备完成后，可以接种到兔骨骼中，制作成兔VX2骨肿瘤动物模型(实质上该肿瘤模型是一种非骨源性的同种异体移植性模型)，该模型传代简易、生物学性质稳定，肿瘤呈浸润性生长、血供丰富，通过进行性破坏骨髓结构，破坏骨皮质及出现骨膜新生骨，发生骨膜反应，类似于恶性骨肿瘤，与人类恶性骨肿瘤生物学行为相似，是临床研究恶性骨肿瘤的理想动物模型[4-6]。

1.2 兔VX2骨肿瘤生长特性

研究发现VX2肿瘤种植于兔骨骼成活后早期体积增长不明显，2周后体积开始呈对数关系增长，接种2周后肿瘤局限于干骺端生长，出现骨皮质破坏及骨膜反应，易发生病理性骨折，3周后软组织肿块出现并逐渐增大，肿瘤突出于皮下并粘连，固定不易推动，开始向骨髓腔扩散，干骺端骨皮质破坏加重，5周时肿瘤常侵犯整个骨髓腔，中心出现明显的坏死，皮质不完整。在镜下可观察到肿瘤细胞呈实体巢状排列密布，胞浆丰富，体积大，核浆比例失调，染色质颗粒较粗，可见病理性核分裂像。在远处转移研究方面，种植VX2肿瘤于兔骨骼3周后肉眼可观察到肺部出现粟粒性结节，7～8周可观察到心、肺、肝、肾等多个脏器转移，其中肺转移率为100%，镜下可观察到转移区域存在大量炎性细胞浸润及纤维结缔组织增生，并且转移区域细胞形态结构与植入肿瘤病灶细胞形态结构完全一致[7-8]。因此在进行兔VX2骨肿瘤模型制作行相关实验研究时，不宜太晚，一般以种植后第3～4周为宜，以免影响实验数据。

2 兔VX2骨肿瘤模型的制作

2.1 种植点的选择

恶性骨肿瘤常发生于人体骨生长活跃处。兔胫骨上端或股骨下端骨皮质相对较厚、血供丰富，易于肿瘤生长，在此建模，与人恶性骨肿瘤好发位置相同，在模型制作成功后，可为模拟观察人恶性骨肿瘤的生物学特性提供理想的动物模型。

在兔VX2骨肿瘤模型制作过程中，主要选择股骨下端、胫骨上端或关节部位作为兔VX2肿瘤种植点。采用兔胫骨干上端内侧平面处为种植点，将VX2肿瘤组织块植入孔道中，此方法较简单易行，造模成功率高，对软组织的剥离较少，术后感染率低，但损坏了骨皮质和骨膜结构及形态，肿瘤可以沿着孔道处骨皮质向外生长，与人恶性骨肿瘤生长方式存在差异，并且孔道处骨膜的破坏不利于对该种植处生物学特性观察[9]；选择兔股骨下端作为种植点，将VX2肿瘤植入骨骼形成移植性骨肿瘤，此种植处肌肉组织丰富，种植点较深，接种难度增加，易发生周围软组织种植转移，并且靠近关节，影响模型兔关节活动，不利于模型兔生理活动的观察[10]；将种植点选择在兔胫骨关节面，使穿刺针与胫骨干平行穿入并将穿刺针头置于骨髓腔，之后将VX2肿瘤悬液植入骨髓腔中，此方法通过胫骨关节面将肿瘤悬液植入骨髓腔中，因肿瘤种植位置位于胫骨中上端，不易发生周围软组织转移，并且对骨膜的损伤较小，但这种方法操作难度高，如果不与胫骨干垂直穿刺则无法完全穿入骨髓腔，易穿至骨皮质内及穿透周围软组织，而且损伤了关节软骨，对关节结构也造成了一定损坏[11]；于兔胫骨上端近平台下2cm处纵行切开约2cm切口，钻孔至骨髓腔，将VX2肿瘤组织块植入骨髓腔，这种方法对正常关节结构未造成破坏，操作简单，但切口较大，对软组织剥离较多，易造成种植点处周围浸润转移并且增加了术后感染率[12]。

对比4种不同种植点，将胫骨关节面作为种植点，与另外3种相比，其对软组织及骨组织的破坏和骨膜的机械性损伤最小，种植深度较深，不易发生局部转移，更有利于兔VX2骨肿瘤模型生物学行为的观察，操作难度虽高，但可通过多次操作后熟练掌握。4种不同种植位置的选择虽与人原发性恶性骨肿瘤常见发生位置相同，但对骨与软组织造成了不同程度创伤，与人原发性恶性骨肿瘤发生机制不相符，在某种程度上不利于恶性骨肿瘤生物学行为观察[13]。因此在选择肿瘤种植点时，需减少对周围软组织的剥离及骨组织的破坏，减小植入孔直径，必要时可在影像学指导下进行操作，尽量制备成与人原发性恶性骨肿瘤相似的动物模型[14-15]。

2.2 种植方法的选择

目前关于兔VX2骨肿瘤的种植主要采取两种方法：肿瘤细胞悬液种植法、肿瘤组织包块种植法。1)肿瘤细胞悬液种植法：将制备完成的VX2肿瘤细胞悬液用针吸管自钻孔处直接注入髓腔，并用骨蜡封堵钻孔，避免细胞悬液外渗造成周围软组织浸润转移，建造兔VX2骨肿瘤模型。悬液种植法依照来源不同分为两种情况。一种为通过从冻存的肿瘤片段体外原代培养VX2肿瘤细胞种植于兔骨骼，经研究发现VX2肿瘤片段经多次传代后可成功建立致瘤性VX2细胞系，并且体外生长的VX2细胞能够维持其成瘤性[16-17]。但体外培养细胞的周期长，耗费人力物力，随着细胞传代次数的增加，肿瘤的侵袭性降低，致使造模成功率降低。另外一种也是目前采用较多的悬液制备方法为：将VX2荷瘤兔的肿瘤组织去除中心坏死组织及纤维结缔组织后剪成1mm3体积大小的碎块，加用溶液搅匀后离心，进行细胞计数，制备成肿瘤细胞悬液[18]；2)肿瘤组织包块种植法：将VX2瘤株置入兔大腿外侧肌中，待肿瘤体积增大到一定范围后(一般2～3周即可)处死荷瘤兔，将肿瘤从大腿中剥离，选取出肿瘤边缘生长旺盛组织，在生理盐水中浸泡，制备成1mm3大小的组织块，将VX2肿瘤组织包块置入骨髓腔中，最后用骨蜡封堵穿刺孔，提高成瘤率，建造兔VX2骨肿瘤模型[19]。

两种不同的种植方法均可制备兔VX2骨肿瘤模型，成瘤率均较高，但两种种植方法的生物学行为差别较大。在肿瘤悬液种植法及肿瘤组织包块种植法的对照研究中，发现细胞悬液组在种植后因骨髓腔压力与外界不同，肿瘤细胞经种植处外渗率高，易向周围组织扩散，并且对骨皮质破坏较轻，而肿瘤组织包块组制作模型，肿瘤体积容易控制，对骨皮质呈进行性破坏，外渗率较低，种植时不易发生异位种植，而且在相同情况下，肿瘤组织包块组更容易成功制备生长形态规则的模型，并能准确反映兔VX2骨肿瘤的病理学改变[20]。

对比VX2肿瘤两种种植方法，种植肿瘤组织包块时需较大直径的种植孔，对种植孔周围组织造成较大的损伤，但肿瘤组织包块制备方法简单，种植深度较容易控制，植入后生长迅速，模型制作时间短，成瘤率高，对骨皮质破坏明显，能更好地模拟人恶性骨肿瘤[21]。

3 兔VX2骨肿瘤模型的研究应用

兔VX2骨肿瘤模型目前主要应用在对恶性骨肿瘤的影像学检查、外周血检测及治疗等研究领域。

3.1 在影像学中的应用

影像学检查即从计算机断层扫描(computed tomography，CT)、磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)和超声等影像中提取并分析高通量的特征，判断肿瘤的生长情况及浸润深度，可为肿瘤精准切除提供依据[22]。兔VX2骨肿瘤模型作为一种类似于人恶性骨肿瘤的动物模型，可以根据不同的实验目的及研究方法，选用一种或多种影像学技术观察其影像学特点；可以连续动态地观察兔VX2骨肿瘤模型，为恶性骨肿瘤影像学的实验研究打下基础。

由于不同物质产生不同的X射线，双能计算机断层扫描(dual-energy CT，DECT)可以通过不同物质的成像差异，制成特定的光谱曲线[23]。运用DECT选择多平面重建图像对兔VX2骨肿瘤模型进行点对点比较，构建DECT光谱曲线，并计算曲线斜率，证实DECT光谱曲线能区分兔VX2骨肿瘤过渡区的微浸润与单纯的骨髓水肿；并且通过注射碘和水比较软组织水肿区、正常肌肉区及软组织浸润区的光谱曲线斜率，证实DECT可以把兔VX2骨肿瘤模型的软组织侵犯、软组织水肿和正常肌肉区别开来[24-25]。

恶性骨肿瘤的真正边界是肿瘤的微侵袭部分，功能磁共振成像可有效评价肌肉和骨骼的功能状态，可准确判断恶性骨肿瘤病变范围[26]。运用磁共振弥散加权成像(diffusion weighted imaging，DWI)对兔VX2骨肿瘤模型进行扫描生成表观弥散系数(apparent diffusion coefficient，ADC)图，通过肿瘤、微浸润区、炎症水肿组织及正常组织ADC值的差异勾勒肿瘤边界，得到兔VX2骨肿瘤较精确范围，并与兔VX2骨肿瘤标本进行比较，发现在ADC图上得到的ADC值可以准确判断兔VX2骨肿瘤的大小及范围[19]。运用Reference-Region模型和Tofts模型的动态对比增强磁共振成像(dynamic contrast enhanced MRI，DCE-MRI)定量参数评价兔VX2骨肿瘤微循环灌注和渗透性特征，两种模型均可有效评价兔VX2骨肿瘤的微循环灌注和渗透性特征，但在低时间分辨率的情况下，Reference-Region模型的重复性更佳[27]。

彩色多普勒血流显像(color doppler flow imaging，CDFI)通过改变信噪比，可显示病变的位置、形态、界限、声学特性以及病变与周围组织的关系，检测血管变化，更好地显示病变特点[28]。Wu等[29]研究兔VX2骨肿瘤的超声血流成像中发现，CDFI不仅能显示兔VX2骨肿瘤内部及边缘有多处血流信号，还可显示骨膜增生，骨膜隆起和增厚。并且通过超声随访，发现还可以根据治疗过程中CDFI所观察到的血液供应的变化来评估是否需要对兔VX2骨肿瘤进行灭活。

兔VX2骨肿瘤模型已在多种影像学检查中广泛应用，通过对兔VX2骨肿瘤进行连续动态影像学监测，可观察到兔VX2骨肿瘤的生长、发展及侵犯情况，使我们对恶性骨肿瘤的生物学特性有更深刻的认识。随着影像学技术的发展及对兔VX2骨肿瘤模型价值的进一步挖掘，影像学检查在恶性骨肿瘤临床诊断及治疗中的应用价值会进一步提高。

3.2 在外周血检测及治疗中的应用

恶性骨肿瘤作为一种人骨骼系统的肿瘤，具有极强的增殖和转移能力，运用兔VX2骨肿瘤模型模拟人恶性骨肿瘤，对该模型进行外周血检测，有助于人们进一步了解恶性骨肿瘤增殖及转移的特征,更好地指导临床治疗，而且可以将新的治疗方式应用于该模型中，证实治疗方式的可行性，逐步地应用于临床之中。

通过外周血检测，观察恶性骨肿瘤相关基因的变化，选择合适的治疗靶点，关系到恶性骨肿瘤的治疗效果。Qian等[30]在建立兔VX2骨肿瘤模型后，运用RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)技术检测了凋亡基因mdm2、Bcl2、P15和NF-κB在肿瘤周围组织中的表达，免疫组织化学染色观察兔肺、肾及膀胱等器官变化，发现mdm2、Bcl2、P15和NF-κB参与了兔VX2骨肿瘤的增殖或转移。其中P15基因只与兔VX2骨肿瘤增殖有关，而与转移并无直接关系。mdm2、Bcl2和NF-κB与肺转移有关，Bcl2与肾转移有关，mdm2和Bcl2与膀胱转移有关。VX2肿瘤是由Shope病毒诱发兔外阴乳头状瘤衍生的鳞状细胞癌，循环血肿瘤DNA(circulating tumor DNA， ctDNA)是来自于血液中游离的肿瘤DNA，运用实时定量PCR技术检测兔VX2肿瘤放疗前后外周血循环Shope病毒特征性DNA片段含量变化，发现血浆中ctDNA含量较放疗前明显降低，说明ctDNA变化可以监测兔VX2肿瘤放疗的疗效，有望成为兔VX2肿瘤特征性肿瘤标记物[31]。

微创热消融是当前治疗恶性骨肿瘤的一种方式，已被证明在一些恶性骨肿瘤患者的治疗中是安全和有效的[32]。Yu等[33]采用了一种新颖的微创治疗方法，以分布在聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate，PMMA)骨水泥中的Fe3O4纳米粒子为基体，制作了一种具有磁性热功能的材料，在交变磁场(alternating magnetic field，AMF)作用下，将其植入兔VX2骨肿瘤处，术后经过CT及病理检测，认为PMMA-Fe3O4不仅能使兔VX2骨肿瘤消退，而且可以达到机械支撑作用。μ-氧代-N，N-双(水杨醛基)乙二胺铁[Fe(Salen)]是一种具有固有磁性的抗肿瘤有机化合物，其抗肿瘤作用与顺铂相似，具有极强的细胞毒性，在兔的舌癌和人胶质母细胞瘤中已验证该化合物的抗肿瘤作用[34-35]，而在兔VX2骨肿瘤中，通过动脉造影使导管到达肿瘤部位，在AMF作用下注射Fe(Salen)至肿瘤血管内，术后2周经影像学及病理检测证明该化合物对抑制兔VX2骨肿瘤增殖有明显效果[36]。

在对兔VX2骨肿瘤模型进行外周血检测及治疗的实验中，发现一些基因与兔VX2骨肿瘤的增殖及转移有关，微创热消融治疗兔VX2骨肿瘤又可明显抑制肿瘤增殖，杀灭肿瘤细胞，促进肿瘤消退，证实了靶向治疗及微创热消融治疗在恶性骨肿瘤的治疗中具有可行性[37-38]。目前对恶性骨肿瘤的治疗方式仍以手术切除与放化疗相结合为主，生存率仍然较低[39-40]，运用兔VX2骨肿瘤模型进行关于恶性骨肿瘤治疗的相关探索，将有利于推动临床上恶性骨肿瘤治疗方式的更新。

4 总 结

兔VX2骨肿瘤模型与人原发性恶性骨肿瘤的生物学特性及治疗敏感性存在一定差异，但并不是本质的差别[41]。兔VX2骨肿瘤模型作为非骨源性的同种异体移植性骨肿瘤模型，其生长形式、浸润程度、转移机制及病理演变过程都与人恶性骨肿瘤近似，而且其生物学性质稳定，传代简易，成模率高且成型周期短，是研究恶性骨肿瘤的理想动物模型。

目前国内外对于兔VX2骨肿瘤模型制作方法多种多样，可通过选择不同种植点及种植方法模拟人恶性骨肿瘤，但如何解决肿瘤种植处的完全封堵，避免影响实验数据，相关报道较少；该模型虽在外周血检测及治疗中得到应用，但关于肿瘤靶向治疗及免疫治疗的研究较少，仍需进一步挖掘兔VX2骨肿瘤模型的实验价值。

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