基于核酸适配体分析方法结合纳米材料监测食品有毒重金属的研究进展

熊金恩，李壹，熊晓辉

（南京工业大学食品与轻工学院，江苏南京211800）

重金属是一种对生物和环境具有严重影响的普遍污染物，随着工业、农业和采矿等各种作业活动的增加，大量的重金属被排放到地表和地下水中[1]。最为关键的是，重金属容易通过食物链系统在动物和人体内累积。这些重金属元素的积累可能会对黏液组织、肠道、骨骼、中枢神经系统、肝脏、肾脏和生殖系统造成严重损害[2]。它们具有产生高反应活性的化学实体的能力，例如产生一些可以引起脂质过氧化、DNA 损伤、蛋白质巯基氧化和其他一些作用的自由基[3]。另外，长期接触有毒重金属可能对动物和人体有致癌作用[4]。因此，有毒金属离子的检测在环境保护和疾病的预防及治疗方面起到十分重要的作用。然而，由于在大多数生物和环境样品中都存在高浓度的干扰基质成分，对痕量重金属的高选择性和灵敏性检测仍然是一个具有挑战性的研究领域。因此，从复杂基质中捕获目标离子是检测重金属的关键步骤。

近年来，适配体作为生物传感器受到国内外研究人员越来越多的关注。适配体最初是由3 个独立小组在1990 年引进，这是一种通过配体指数富集系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）产生的一类人工寡核苷酸探针。它们可以结合多种靶点，包括小分子[5]，离子[6]，蛋白质[7]，细胞[8]，组织和生物体[9]。与传统重金属检测方法相比，DNA 具有许多用于金属检测的理想特性。首先，DNA是聚阴离子，可以与金属离子静电吸引，同时DNA 高度稳定；其次，DNA 在变性后可以复性而不会丧失其金属结合亲和力；第三，DNA 的化学合成的成本低廉，且基本可在任意选择的位置进行各种修改。最后，通过不同碱基结合可以筛选出不同金属离子的特异性适配体。尤为重要的是，适配体生物传感技术可以在大多数具有通用设备的实验室进行重金属分析试验。当然，适配体生物传感器与传统方法相比仍然具有结合亲和力强、灵敏度高、选择性优异、稳定性好、免疫原性和毒性低[10]等一系列优点。因此，适配体生物传感技术越来越成为生物和环境样品中重金属离子识别的理想选择。

目前为止，国内外研究人员已经设计出了一些用于识别和检测重金属离子[主要是铅（Pb），汞（Hg），镉（Cd），银（Ag）和砷（As）]的 DNA 适配体，这些离子可以与DNA 的碱基特异性相互作用，形成强而稳定的复合物。此外，国内外研究人员对DNA 和金属的协调作用已经做了广泛的研究[11]。在最简单的水平上，DNA 的磷酸骨架通过静电相互作用与金属结合，从而稳定DNA 双链体。然而，在此基础上，还要考虑到金属离子和DNA 的化学性质，例如：1A 和2A 族金属主要与磷酸骨架相互作用从而保持双链DNA 稳定性；第一行过渡金属Cd2+，Pb2+和三价镧系元素与磷酸盐和碱基相互作用；较软的金属如Ag+和Hg2+主要与DNA 碱基相互作用[12]；一些金属如铂和铬几乎不可逆地与DNA 碱基结合[13]。据报道，具有非重复富含胸腺嘧啶（T）和鸟嘌呤（G）的单链DNA 序列被证实可以与Cd2+结合[14]。一些金属离子 （K+，Na+，Ca2+和 Pb2+） 可影响富含 G 的DNA，使其发生从无规卷曲到G-四链体结构的构象转变[15]。在Hg2+和Ag+离子存在的情况下，T-T 错配会选择性捕获 Hg2+形成 T-Hg2+-T 复合物[16]，而胞嘧啶（C）-胞嘧啶错配只能识别Ag+形成C-Ag+-C 复合物[17]。阳离子结合核酸并诱导形成二级结构的能力可以归因于阳离子性质如离子半径，配位行为和水合作用[18]。

最近，金属离子-寡核苷酸碱基的配位化学在生物传感器的发展中受到了国内外研究人员的广泛关注。由于这些重金属离子和碱基之间可以进行高度特异性结合，因此，所设计的传感器可以在其他离子存在的情况下针对靶标离子实现特异性选择。此外，在这些系统中使用纳米材料可以有效地提高它们的性能。随着纳米技术的发展，纳米材料越来越普遍地被用作固定适配体的平台[19]。它们在适配体的累积量、定向和组装密度控制中起着重要的作用，可以优化检测体系的识别能力。纳米材料也可能会导致电化学生物传感器中的电子转移加速[5]。

纳米材料，例如金属纳米颗粒，半导体量子点（semiconductor quantum dot，QDs），碳纳米材料，二氧化硅纳米颗粒和磁性纳米颗粒，具有独特的光学，电子，磁性和催化性质。这些特性使其越来越多的用于构建新型基于适配体结合纳米材料的生物传感器。特别地，纳米材料的大表面积与体积比可以使其高效率的结合适配体，从而将检测信号大大增强并通过协同相互作用提高目标识别性能[20]。此外，大多数纳米材料显示出不同寻常的生物相容性，它们可以保护核酸免受核酸酶消化在生命系统中造成的损害[21]，使得适体组装的纳米材料有利于医学诊断应用。纳米材料辅助适体传感器在传感应用中显示出前所未有的优势，并引起了多学科研究的重大兴趣。适配体与纳米材料结合主要通过两种方法，即共价连接和非共价连接。共价连接主要是通过化学吸附，例如：硫醇化的适配体可以很容易地化学吸附到金纳米颗粒（AuNP）的表面上[22]，而胺标记的适体可以容易地吸附在羧基改性的二氧化硅纳米颗粒（SiNP）的表面上。而非共价连接主要利用静电吸附机制，例如：带负电荷的适体可以吸附到带负电荷的AuNP 表面上[23]。

因此，基于不同适体与新型纳米材料的组合，已经开发了各种用于重金属离子检测的传感系统。本文将提供一些基于适配体结合纳米材料的生物传感技术分析有毒重金属离子 （例如 Cd2+，Pb2+，Hg2+，Ag+，As3+）的方法简介，便于读者借鉴。

1 传统检测方法

重金属是一种可导致严重生物和环境问题的普遍污染物，一直受到广大科研工作者的关注。下面列举几种常见的有毒重金属并分别介绍其传统的检测方法。

铅是可能对人体器官和环境造成严重影响的最危险的重金属之一[24]。所有形式的铅都是有毒的，并且会对生殖，神经，免疫，心血管系统以及儿童发育过程产生危害[25]。据报道[26]，血液中Pb2+的最大可接受浓度为10 μg/dL。由于Pb2+的高毒性会对公众健康产生巨大影响，开发可靠、精确和灵敏的方法来测定食品中痕量的铅元素对国内外研究人员而言十分有必要。电感耦合等离子体质谱法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）、电感耦合等离子体发射光谱法（inductively coupled plasma optical emission spectrometer，ICP-OES）、电热原子吸收光谱法（electrothermal atomizationatomic absorption spectrometry，ET-AAS）和火焰原子吸收光谱法（flame atomic absorption spectrometry，FAAS）是检测Pb2+最常用的分析技术。但是，这些技术在分析之前需要对目标离子进行复杂的前处理。在环境、药物和食品分析领域越来越多的科学家致力于开发新的传感器来直接、准确、快速和选择性地测定重金属[27]。

汞是一种众所周知的剧毒重金属，以金属，无机和有机形式存在。水溶性的Hg2+是无机汞中最稳定和传播最广泛的形式之一，其有两种来源：天然来源和工业排放。汞在食物链中积累会对人体产生极其严重的健康危害[28]。此外，有机和无机形式的汞都具有神经毒性。据报道，汞引起的神经毒性会导致人的听力下降、精神恶化、言语障碍、视力受损、前庭功能障碍，甚至使人产生自闭症[29]。整个血液中的汞浓度通常低于10 μg/L，一般低于 20 μg/L 被认为是正常的，长期暴露于汞蒸气后，血汞浓度可升至35 μg/L[30]。考虑到环境和生物样品中汞的含量较低，提高Hg2+检测的选择性和灵敏度对分析人员来说尤为重要。为了实现这一目标，国内外研究人员已经开发了许多不同的分析方法，包括中子活化分析（neutron activation analysis，NAA），冷原子荧光/吸收光谱法（cold-vapor atomic fluorescence spectrometry，CV-AFS/cold-vapor atomic absorption spectrometry，CV-AAS），ICP-MS，ICP-OES，极谱法等[31]。

砷是一种广泛分布于世界许多地区的有毒致癌物质。虽然砷在自然界存在不同的化学形式，但As3+被认为是元素毒性最强的形式[32]。人类可能会通过直接和间接的方式摄入砷，也就是说，土壤中的砷会积累到农作物中，同时受污染的饮用水中也会有砷。砷会在角蛋白含量高的组织中积累，如皮肤、头发和指甲[33]，并且许多疾病与砷的积累有关，如皮肤损伤，癌症和循环系统问题[34]。目前，常用的砷检测方法有色谱法，光谱法和电化学方法[35]。

镉是毒性最强的金属之一，它可以通过地球的食物链系统在动物和人体中进行生物积累。急性镉中毒的症状包括高血压、肾脏损害、贫血、癌症等[36]。血液中可接受的 Cd2+浓度约为 5 μg/L～10 μg/L[37]。ICP-OES，ICP-MS，ET-AAS，FAAS 和电位滴定法等几种方法是镉检测的常用方法[36]。

与大多数其他重金属相比，银化合物的毒性较低，因为它们在消化时人体只会有很少量的吸收[38]。然而，某些银化合物大量存在的情况下会具有毒性。由于银离子对硫氢键和氨基有很强的亲和力，因此在体内银离子会与氨基酸，核酸和其他化合物发生络合作用[39]。此外，银离子具有生物活性并容易与哺乳动物和真核细胞膜上的受体相互作用[38]。正常情况下，人体血清中 Ag+的含量低于 2 μg/L[40]。目前来说，ICP-OES、ICP-MS、ET-AAS、FAAS 和电化学方法等各种检测技术已被广泛用于选择性地检测Ag+[41]。

目前，重金属检测的传统方法虽然应用比较成熟、灵敏度高，但同时也存在诸多局限性，如：仪器价格昂贵、操作复杂、耗时长，需要专业人员操作等[42]。难以满足简单、快速、实时检测的实际需要[43]。因此，寻求一种简单、快速、灵敏的重金属检测方法具有非常重要的意义。

2 基于生物传感器的适配体技术结合纳米材料检测重金属方法

现如今，适配体一直被认为是对重金属进行生物和环境监测中非常有前途的工具。生物传感器是一种快速简单的方法，而且，其具有很高的灵敏度和选择性。例如：Pb2+和富含G 的适配体具有高度特异性结合能力[44]，即便是对于已知的可以稳定G-四链体的阳离子，如 Na+、K+、Ca2+，也仅仅显示出稍高于背景的信号[45]。由于具有特异性的T-Hg2+-T 相互作用，基于富含T 的适配体的生物检测系统可以实现在其他金属离子存在的情况下对汞离子进行特异性检测[46]。Kim 等[47]基于SELEX 过程对配体进行系统地优化，使用亲和柱在体外筛选了可结合砷的DNA 适配体。这种单链DNA 适配体含有100 个核苷酸，对As3+具有非常高的亲和力，解离常数为7.05 nmol/L。

2.1 电化学适配体传感器

随着国内外研究人员对寡核苷酸与金属离子之间相互作用的深入研究，适配体分子已被认为是用于构建 Pb2+、Hg2+、As3+、Cd2+等重金属检测的电化学生物传感器的强有力受体。Jarczewska 等[48]开发了一种灵敏度高、选择性好的安培检测平台，以亚甲基蓝为指示剂，测定Pb2+，亚甲基蓝可与带负电荷的磷酸骨架和G-四链体（G4）环形成氢键或产生阳离子-偶极相互作用。它可以有效地插入到形成的G4 中，产生容易测量的“增强”的电化学信号，而且G4 的量取决于Pb2+的浓度。该传感器对Pb2+的电化学响应范围为0.05 μmol/L～1 μmol/L，最低检出限为 34.7 nmol/L。Lin 等[49]报道了一种基于Hg2+与T-T 错配而形成T-Hg2+-T 复合物的阻抗适配体传感器用于测定Hg2+。电荷转移电阻（ΔRCT）在 0.1 nmol/L～1×104nmol/L 范围内与 Hg2+浓度的对数呈线性关系，检出限为0.1 nmol/L。Wen 等[50]介绍了基于As3+的特异性结合适配体（specific binding probe，SBP）建立的伏安法测定砷As3+的电化学检测方法。首先，SBP 与金电极表面上的捕获探针（capture probe，CP）杂交。然后，指示剂亚甲基蓝插入到电极上的SBP/CP 混合物中。加入As3+后，它特异性地与SBP 结合，这导致SBP 的构象变化，从而使SBP 从电极上解离到溶液中。因此，电极上残留的MB 量减少，从而降低了MB 的峰值电流。该方法在 0.1 μg/L～200 μg/L 浓度范围内对As3+具有线性响应并且检出限低至75 ng/L。Lin等[49]报道了一种基于Ag+与C-C 错配以形成C-Ag+-C复合物的阻抗适配体传感器。结果表明：100 nmol/L～800 nmol/L 范围内ΔRCT与Ag+浓度的呈线性关系，检出限为10 nmol/L。

纳米材料的引入可以有效提高适配体的固定量。此外，它们在适配体的取向和组装密度控制中发挥重要作用，以实现最佳识别能力。近年来，将适配体与纳米材料结合使用的分析方法受到越来越多的关注。Xu等[51]用富含G 的铅特异性适配体作为Pb2+的识别元件，利用银铂纳米颗粒修饰的金属有机骨架作为电化学信号增强子，开发了无标记、无酶的Pb2+电化学适配体。将适配体温育到修饰的电极表面上，若不存在Pb2+，通过杂交反应，未折叠的适配体在电极表面捕获了其互补链，而互补链结合了金属有机骨架可提供电化学信号，在Pb2+存在的情况下，适配体会折叠成稳定的G-四链体结构，难以结合其互补链从而导致电化学信号变化。此项研究开发的适用于Pb2+的适配体表现出了从0.1 pmol/L～100 nmol/L 的宽线性范围，检出限为0.032 pmol/L，特异性好，稳定性强，重现性好。Babamiri 等[52]设计了用于选择性检测Hg2+的超灵敏电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）适配体检测方法。固定在修饰后的四氧化三铁枝状聚合物（Fe3O4@SiO2/QDs）上的富含 T 的单链 DNA（S1）和修饰了 AuNPs 的互补适配体（AuNPs-S2）杂交，QDs 纳米复合物的ECL 被有效猝灭，而在Hg2+存在的情况下，由于稳定的T-Hg2+-T 复合物的形成，AuNPs-S2被释放，这样QDs 的ECL 信号再次得到恢复。在最佳条件下，该适配体传感器用于Hg2+检测，线性范围为20 amol/L至2 μmol/L，检出限为2 amol/L。他们又将该适配体传感器用于检测自来水、鲤鱼和咸水鱼样品中的Hg2+，结果令人满意。Wang 等[53]通过构建用于识别Cd2+的特定适配体和还原氧化石墨烯（reduced graphene oxide，rGO）/石墨碳氮化物（graphite carbon nitride nanocomposites，g-C3N4）的复合体系开发了新型传感器。该电化学生物传感器对于Cd2+检测显示出良好的灵敏度、特异性、重现性和稳定性。线性范围从1 nmol/L～1 μmol/L，检出限为0.337 nmol/L。

2.2 荧光适配体传感器

过去几年，检测重金属的荧光生物传感器的开发取得了很大进展。Huang[54]等报道了基于超敏感双链DNA 的特异性染料PicoGreen 和无标记寡核苷酸的传感器。该方法的原理是Pb2+诱导富含G 的凝血酶适配体从无规卷曲变为G-四链体，从而阻止该适配体与其互补序列结合形成双链DNA 并引起PicoGreen 荧光强度降低。结果表明，该方法满足Pb2+最大残留限量（maximum residue limit，MRL）的要求，线性动态范围为1 ng/mL 至1 mg/mL 以上，可检测到Pb2+的最低浓度为1 ng/mL。此外，整个检测过程可以在不到30 min 内完成。因此，该方法简单、快速并可用于Pb2+的高灵敏度分析。Sun 等[55]基于磁分离和T-Hg2+-T 碱基对的形成，开发了一种Hg2+的荧光测定法。其设计原理为：将适配体固定在磁珠表面以形成适配体功能化磁珠（aptamers-functionalized magnetic beads，AMB），在不存在Hg2+的情况下，信号转导探针（signal transduction probe，STP）可以通过互补碱基配对与AMB 组合，磁分离后检测溶液中几乎没有STP，导致荧光信号很弱。Hg2+的存在会形成T-Hg2+-T 碱基对。磁分离后，Hg2+从系统中分离出来，STP 留在溶液中，荧光信号显著增强。随着Hg2+浓度从2 nmol/L 增加到160 nmol/L，荧光强度呈线性增加，检出限为0.2 nmol/L。该方法已成功应用于带状鱼中Hg2+的测定和定量，回收率良好，结果与原子荧光结果完全一致。

各种纳米结构，尤其是量子点是用于荧光生物感应的良好荧光团[56]。此外，金属纳米簇（nanoclusters，NCs）是一类新的材料，可表现出类似分子的光谱行为。金和银纳米簇在检测各种分析物方面受到相当大的关注[57]。几种纳米材料已经表现出对广泛荧光团的高淬灭效率，使其可用于基于荧光的生物测定[58]。碳纳米管（carbon nanotube，CNT）、氧化石墨烯等纳米材料可以有效地猝灭固定到DNA 上的染料的荧光[59]。基于这个特点，国内外研究人员已经开发了多种荧光适配体传感器来检测重金属离子。Zhang 等[60]使用Pb2+的特异性适配体修饰的银纳米团簇（Ag NCs）构建了一种新型荧光生物传感器。在Pb2+存在下，Pb2+诱导适配体形成G-四链体，并使位于3'和5'末端的两个黑色DNA/Ag NC 闭合，导致荧光增强。该法可以在5 nmol/L～50 nmol/L 的线性范围内检测Pb2+，检出限低至3.0 nmol/L。Abdelhamid 等[61]报道了一种基于Hg2+适配体结合rGO设计的传感器用来选择性地检测Hg2+。其原理是：胸腺嘧啶（T）和Hg2+之间形成复合物然后再在rGO 的表面上形成[Hg（T）2（H2O）2]n络合物，这导致rGO 的荧光发射被淬灭。所提出的基于rGO 的适配体传感器的检测范围在100 nmol/L～700 nmol/L，并且对于Hg2+检出限低至5 nmol/L，除了灵敏度高和选择性好之外，该方法简单方便、快速直接。Oroval 等[62]基于适配体与介孔二氧化硅纳米粒子的组合开发了一种具有高选择性和强灵敏性的检测As3+的新型传感纳米探针。制备的纳米探针检出限为 0.9 μg/L，检测范围在 4 μg/L～60 μg/L。其数据表明该传感器其对As3+的较好选择性，该传感器在As3+的检测分析中显示出巨大的潜力。

2.3 比色适配体传感器

在各种光学方法中，比色适配体传感器由于具有响应快速、操作简单和灵敏度高的特点而引起了国内外研究人员广泛的关注。比色法是分析应用的常用方法，因为目标识别仅仅通过肉眼就能看出来[63]。AuNPs因其独特的特性而被用作用于比色生物传感器的纳米组装单元，这些特性包括易于合成、独特的光学、热学和电学特性和与生物分子的完美相容性[64]。最重要的是，AuNPs 的表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）和胶体稳定性是比色产生的决定因素[65]。具体的现象即为：分散良好的AuNPs 溶液呈红色，而聚集的 AuNPs 呈蓝色（或紫色）。Shahdordizadeh 等[66]介绍了一种用于敏感和选择性检测Pb2+的比色法，在不存在Pb2+的情况下，AuNPs 上的双链DNA 可以防止在NaCl 存在下AuNPs 的聚集。然而，在Pb2+存在下，适配体结合Pb2+后，互补链被释放并被核酸外切酶I 裂解，当加入盐后，AuNPs 溶液的颜色从红色变为紫色。该法检出限低至2.4 nmol/L。Taghdisi 等[64]开发了基于聚乙烯亚胺和AuNPs 的Pb2+的敏感、选择性好和快速的比色适配体传感器。聚乙烯亚胺可以使AuNPs 聚集，在加入Pb2+后，适配体发生构象变化并形成G-四链体适配体/Pb2+复合物，导致AuNP 聚集并且颜色变为蓝色。在Pb2+不存在的情况下，适配体会与聚乙烯亚胺结合。因此，AuNPs 保持分散使溶液保持稳定的酒红色，该法检出限低至702 pmol/L。Tan 等[67]报道了一种基于适配体-靶标特异性结合和AuNPs 生长的多功能和灵敏的Hg2+比色传感器。他们先选用15 个A 碱基的适配体（15-mer），Hg2+存在时会与适配体结合，使适配体偏离AuNP 种子的表面，然后用羟胺（NH2OH）和原氯金酸（HAuCl4）反应控制AuNPs 种子的生长，适配体覆盖度不同的AuNPs 种子生长是不同的，该法得到了9.6×10-9mol/L 的检出限，随后他们通过分别增加15-mer 序列的一侧和两侧的碱基使AuNPs 的生长发生变化从而使比色信号得到很大改善。对于25-mer和59-mer 的适配体，获得的检出限分别为4.05×10-9mol/L和3×10-9mol/L。这种简单、可视化和低成本的Hg2+传感器在环境监测方面具有巨大的潜力。Wu 等[68]设计了一种比色适配体传感器用于As3+的灵敏检测。其原理是基于二烯丙基二甲基氯化铵 [poly（diallyldimethylammonium），PDDA]、适配体和As3+之间的相互作用可以控制AuNPs 的聚集。在As3+存在下，由于形成了适配体/As3+复合物，导致适配体首先被耗尽，从而PDDA使AuNPs 聚集，进而产生颜色的显著变化即从酒红色变成蓝色。通过这种方法，As3+在水溶液中检出限低至5.3 μg/L。此类As3+的生物传感器将在食品样品检测中发挥重要作用。Wu 等[14]基于SELEX 程序使用亲和柱体外筛选了可与镉结合的DNA 适配体（命名为Cd-4适配体）。并提出了一种新型的用于Cd2+检测的比色方法，该方法基于适配体与水溶性阳离子聚合物-PDDA之间的特殊相互作用从而导致AuNPs 的聚集[69]。该方法已用于检测水溶液中的Cd2+，检出限为4.6 nmol/L。Xi 等[70]开发了适配体官能化的金纳米粒子，用于Ag+的快速、高选择性和高灵敏度检测。该比色传感器检测到Ag+的浓度低至0.236 nmol/L。除了宽线性（1 nmol/L～1 μmol/L）和低检测极限（0.236 nmol/L）外，该传感器具有近实时（2 min）的分析功能。

3 结论与展望

功能性核酸自被发现以后，不断地被用作有效的传感工具。目前，在分析化学中使用DNA 或RNA 适配体是一个非常有前途的研究领域，因为它们具有与抗体相似的亲和力，能够特异性结合目标。本文介绍了可用于监测生物和环境样品中 Pb2+、Hg+、Cd2+、Ag+、As3+的各种基于适配体的检测方法。近年来，因为经济、敏感度高、选择性好和易于构建等优点，人们对利用寡聚核苷酸作为识别元件与分析技术相结合的新型检测方法的兴趣日益浓厚。此外，基于纳米材料的染料、电化学信号放大器、猝灭剂和吸附剂在改进生物传感器方面具有着十分光明的前景。因此，基于适配体的检测，尤其是适配体传感器与纳米材料的结合是一个非常热门的研究领域，不久的将来，我们将看到其对不同目标进行分析的新的振奋人心的成就。