食源性病毒分子生物学检测技术研究

食源性病毒是由食物引起导致人类发生疾病的病毒， 主要通过粪－口途径传播， 食用被污染的食品、水，含病毒的排泄物和呕吐物均可导致感染。 常见的食源性病毒包括诺如病毒、甲肝病毒、猪瘟病毒、轮状病毒、冠状病毒等。 早期的食源性病毒检测方法主要有电镜观察法、酶联免疫法等，但检出率不高，有较大的局限性。而分子生物学方法灵敏度高，特异性强，能快速、灵敏、准确地检测临床标本中的食源性病毒，推动了病毒的流行病学研究。

分子生物学检测步骤主要包括样本的前处理方法、 核酸提取方法和核酸扩增检测技术等。 王之莹等（2020）研究了利用侧流核酸试纸条快速检测非洲猪瘟病毒，其将传统聚合酶链式反应(PCR)与胶体金试纸条技术结合，开发一种低成本的侧流核酸测定试纸条(LFNAA)。该体系设计了独特的尾引物，避免了传统核酸试纸条的半抗原标记及抗体的使用。 经过PCR 扩增后产生一端带着单链寡核苷酸尾巴的双链DNA 产物，能够与胶体金标记的寡核苷酸捕获探针结合，从而在试纸条上形成可以用肉眼观察的目标产物。 该技术可进一步结合等温扩增技术， 能够在食品安全和医学诊断中实现更快更简便的现场检测。 张彩虹等（2019）根据非洲猪瘟病毒(ASFV)保守的VP72 基因序列，设计特异性引物和探针，经过优化反应体系中各组分及反应条件，建立了直接检测样品中ASFV 的荧光定量PCR 方法，并分析该方法的特异性和敏感性。孙亚萍等（2008）建立适用于牡蛎和粪便中快速、特异、灵敏的GⅠ、GⅡ型诺如病毒(NV)定量分型诊断方法。 方法：通过对GⅠ、GⅡ型NV 基因组保守序列的比对分析,设计高度特异的引物和探针,建立以TaqMan探针为基础的实时聚合酶链反应方法(TaqMan Real-time RT-PCR)。 中国专利 CN200880021273.7 公开了一种改良的诺如病毒RNA 检测方法，其包括以下工序：使用下述引物对中的至少两组，通过逆转录酶，生成包含启动子序列的双链DNA，所述引物对为：由对于与诺如病毒的各个基因型的RNA 相同或者互补的核酸序列杂交效率高的第一引物和第二引物(该引物中的任意一者的5′末端附加有启动子序列)组成的引物对；以该双链DNA 作为模板，通过RNA 聚合酶生成RNA 转录产物；该RNA 转录产物继续作为利用所述逆转录酶合成DNA 的模板，生成所述双链DNA。 在所述RNA 扩增工序中，通过用嵌入剂性荧光染料标记的核酸探针测定被扩增的RNA 转录产物量。 CN201911302311.2 公开一种非洲猪瘟病毒的锁核酸探针荧光定量PCR 检测组合物、检测方法及检测试剂盒，该发明的检测引物、探针和检测试剂盒，利用锁核酸的特点，设计含有锁核酸的特异性探针，该探针对DNA 有强大的识别能力和强大的亲和力，从而能够很好地应用于非洲猪瘟病毒精准检测，提高了非洲猪瘟病毒的检测效率。 CN201910963376.5 涉及一种非洲猪瘟病毒荧光定量PCR 检测试剂盒，所述试剂盒包括：缓冲液B1、缓冲液B2、PCR 反应液、阳性对照和阴性对照；缓冲液B1 快速裂解样品，释放病毒核酸；缓冲液B2：用于稳定提取的病毒核酸，消除对PCR 反应的抑制作用；PCR 反应液： 由2×Premix Ex TaqTM 酶混合液和ASFV 特异性的上下游引物以及荧光探针组成， 其中酶混合液中添加有Tli RnaseH。 该发明使用易于裂解的两种缓冲体系直接对样品中的核酸DNA进行裂解，不仅大大减少了样品提取核酸DNA 的时间和操作步骤，节省了检测时间，且适于运输和保存。CN201810155282.0 公开了一种非洲猪瘟病毒荧光PCR 检测试剂盒， 包括ASFV-反应液、DNA 酶混合液、ASFV-内标、ASFV-阳性对照、ASFV-阴性对照、核酸释放剂以及ASFV-定量参考品，所述ASFV-反应液包括：引物：ASF03F03 和 ASF03R03；内标引物：IPC05F01 和 IPC05R01；探针 ASF03P 和内标探针 IPC05P；所述引物和探针对应于非洲猪瘟病毒p72 基因的高度保守片段。N201310629121.8 公开一种检测猪瘟病毒的RT-LAMP 核酸试纸条试剂盒及应用。该试剂盒包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6 所示的引物组和核酸检测试纸条。 使用方法如下：首先配制RT-LAMP 反应体系，包含AMV 逆转录酶、一倍反应缓冲液、链置换DNA 聚合酶、dNTP 混合物、 甜菜碱、MgSO4、FIP 引物、BIP 引物、Probe 杂交探针、LoopB 引物、F3 引物、B3引物以及待测样品RNA；恒温反应所得产物用核酸检测试纸条检测后直接进行判读：阳性结果为出现两条红色条带，一条位于检测区内，另一条位于质控区内。该试剂盒操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，易于大范围推广应用。

食源性病毒作为引发食品安全事件的主要病原受到广泛关注， 开发食源性病毒的便携式快速检测方法具有重大的实际意义。研究人员可通过恒温检测方法结合新型纳米材料、试纸条、电化学传感器、微流控芯片等方式，实现更快捷、更通用、更便携的食源性病毒核酸检测，保障食品安全。