新型近红外花菁类光声探针用于肼检测

蒋 超，林 静，黄 鹏

深圳大学医学部生物医学工程学院，广东深圳518060

肼(N2H4)是一种常见的化工原料，是合成聚合物、纺织染料和医药中间体等的重要前体[1].肼具有易燃易爆特点，被广泛应用于火箭燃料和重氮燃料的生产中[2].但是，肼对皮肤有很强的侵蚀作用，尤其对眼睛和肝脏等器官有严重的损伤作用，被列为常见致癌物之一[3-4].因此，肼的检测对环境保护和生命健康都具有重要意义.

目前，关于肼的检测方法主要有库仑法[5-6]、电位滴定法[7-8]和荧光检测法[9-10].其中，库仑法和电位滴定法操作复杂，检测时间长，且无法实现活体生物组织检测[11]；荧光检测法因具有灵敏度高、采集样品时间短和时间分辨率高的优点而被广泛用于科学研究[12].然而，荧光成像的激发光波长范围通常在400～700 nm，组织穿透深度有限，对于深层组织无法检测，并且生物组织自发荧光背景较强，严重干扰其在活体生物组织中的应用[13-14].因此，找出一种实时、快速，且可用于活体深层组织肼检测的方法非常有意义.

光声检测(photoacoustic detection, PAD)是一种利用光声成像(photoacoustic imaging, PAI)对待测物进行检测的新技术，主要基于光声(photoacoustic，PA)探针和检测物之间的相互作用，根据PA信号的变化作为指标，实现对待测物的检测[15].与其他成像方式相比，PAI是一种新兴的无创、非电离成像，当脉冲激光射入生物组织时，组织吸收脉冲激光能量转化为热能，引发热弹性膨胀，从而产生超声信号，超声探头收集到超声信号并成像.PAI结合了光学成像和超声成像两者优点，具有对比度丰富、分辨率高和深层组织穿透力强等优点[16].因此，PAI可提供深层组织一些特定目标的高分辨率图像信息[17].目前已开发出多种基于无机或有机材料的PAI造影剂用于肿瘤和组织器官的成像[18-20].随着PA探针的发展，PAD已被广泛应用于肿瘤诊断[21-22]、离子检测[23-27]以及酶检测[28-30]等领域.但是，目前肼检测的光声探针还有待开发.

本研究提出了利用花菁类染料为母体，设计并合成了一种新型PA分子探针(Cy-2)，成功实现了对肼的有效检测.

1 实 验

1.1 试 剂

2-[2-[2-氯-3-[2-(1,3二氢-1,3,3-三甲基L-2H-苯并吲哚-2-烯基)-乙烯基]-1-环己烷-1-基]-乙烯基]-1,3,3-三甲基-1H-苯并吲哚鎓对甲苯磺酸盐(IR-813，C47H47ClN2O3S)、N,N-二甲基甲酰胺(dimethyl formamide, DMF)、三乙胺(C6H15N triethylamine, TEA)、丙烯酰氯(C3H3ClO)、硫酸钠(Na2SO4)、硝酸钠(NaNO3)、氯化铵(NH4Cl)、六水合硝酸锌(Zn(NO3)2·6H2O)、氯化汞(HgCl2)、氯化镁(MgCl2)、氯化铜(CuCl2)、氯化锰(MnCl2)、醋酸铅((CH3COO)2Pb)和肼(N2H4·H2O)均购自北京百灵威科技有限公司；乙酸钠(C2H3NaO2)购自上海萨恩化学科技有限公司；二氯甲烷(CH2Cl2, dichloromethane, DCM)和氯化钠(NaCl)购自西格玛-奥德里奇中国；溴化钾(KBr)、硝酸银(AgNO3)和氯化钾(KCl)购自上海麦克林生化科技有限公司.以上所用试剂均为分析纯，无特别说明时均未提纯处理，且所有溶液均由去离子水(millipore, direct-Q 3 超纯水系统)配制.

1.2 仪 器

紫外-可见光分光光度计(安捷伦科技(中国)有限公司生产，型号为Cary 60)；小动物活体光声成像系统(型号为Vevo LAZR2100, VisualSonics富士公司生产).

1.3 合成步骤

本研究合成的Cy-2探针由花菁染料IR-813衍生物Cy-1与烯丙酰氯酯化反应得到，合成步骤如图1.

图1 探针Cy-2的合成步骤

1.3.1 Cy-1的合成

在氮气保护下，将化合物IR-813(305 mg，0.50 mmol)溶于无水DMF(10 mL)中，然后加入乙酸钠(123 mg, 1.50 mmol).反应混合液加热至90 ℃，搅拌3 h后，冷却至室温.除去溶剂，粗产物使用石油醚和乙酸乙酯(体积比为3∶1)作为洗脱剂洗脱，利用硅胶柱层析分离得到红色固体粉末Cy-1，151 mg，产率65%.

1.3.2 Cy-2的合成

在氮气保护下，将化合物Cy-1(780 mg)和TEA(170 mg)溶于无水DCM(20 mL)中，搅拌15 min，然后在冰浴条件下逐滴加入丙烯酰氯(456 mg)的DCM溶液，继续搅拌20 min.暖至室温，搅拌3 h.除去溶剂，使用DCM和甲醇(体积比30∶1)作为洗脱剂洗脱，利用硅胶柱层析分离得到绿色固体粉末Cy-2，392 mg，产率42%.化合物的氢(1H)核磁共振谱(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)(500 MHz, CDCl3)化学位移δ分别为7.97～7.80 (m, 41H), 7.79 (d,J= 2.4 Hz, 15H), 7.39 (d,J= 30.9 Hz, 28H), 7.28 (s, 9H), 7.15 (s, 9H), 6.92 (d,J= 7.5 Hz, 9H), 6.53～6.33 (m, 9H), 6.26 (s, 9H), 6.06 (dd,J=14.7, 8.1 Hz, 7H), 6.03～5.87 (m, 12H), 5.28 (s, 19H), 5.05 (s, 9H), 4.29 (dd,J=15.0, 6.2 Hz, 9H), 3.30 (s, 27H), 2.72～2.68 (m, 9H), 2.59 (s, 27H), 2.35～2.31 (m, 7H), 2.30～2.26 (m, 7H), 1.83 (s, 1H), 1.79 (d,J= 20.6 Hz, 64H), 1.70 (s, 7H), 1.47 (d,J=16.6 Hz, 63H), 1.39 (s, 7H).电喷雾质谱(electrospray ionization-mass spectrometry, ESI-MS)：[M]+= 621.3423(计算得C43H45N2O2+: 621.33).

1.4 溶液配制

探针配制：准确称取Cy-2探针24.84 mg溶解于4 mL的甲醇中，终浓度为10 mmol/L.

肼及各种离子溶液的配制：通过将肼及各种离子相应的盐分别为Na2SO4、NaNO3、NaCl、KBr、CH3COONa、NH4Cl、NaCl、KCl、AgNO3、Zn(NO3)2、HgCl2、MgCl2、CuCl2、MnCl2或(CH3COO)2Pb)溶于去离子水中，制备各种离子溶液(SO42-、NO3-、Cl-、Br-、CH3COO-、NH4+、Na+、K+、Ag+、Zn2+、Hg2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Pb2+和肼)，浓度均为3 mol/L，备用.

2 结果与分析

2.1 Cy-2对肼的检测灵敏度研究

为探究Cy-2对肼的光学响应，采用紫外-可见分光光度计测定不同浓度肼对Cy-2的吸收光谱影响；采用小动物光声成像系统测定加入不同浓度肼后的Cy-2 探针在808 nm处光声强度P(808)变化.

向Cy-2(10 μmol/L)溶液中，逐渐加入肼(0～10 μmol/L)，测定不同浓度的肼对Cy-2溶液吸收光谱的影响，结果如图2.随着溶液中肼浓度的增高，Cy-2溶液体系在波长为808 nm处的光密度D(808)显著下降，而550 nm处的光密度D(550)明显升高.同时，在肼浓度由0～10 μmol/L变化时，伴有明显的颜色变化(图2插图).在肼浓度为0～5 μmol/L内，Cy-2在808 nm和550 nm处的光密度比值D(808)/D(550)与肼浓度具有良好的线性关系，如图3.依据图3(b)的线性关系，可以根据D(808)/D(550)比值推算出待测物中肼的浓度.

图2 Cy-2(10 μmol/L)与不同浓度(0～10 μmol/L)肼反应后的吸收光谱图

图3 Cy-2与不同浓度肼反应后的D(808)/D(550)

然后，测定不同浓度的肼对Cy-2溶液光声强度的影响.向Cy-2(10 μmol/L)溶液中分别加入不同浓度的肼(0～10 μmol/L)，结果如图4.随着溶液中肼浓度的增高，探针的P(808)明显下降，且在一定浓度内(0～10 μmol/L)，P(808)与肼浓度具有良好的线性关系，如图5，肼检测限为0.50 μmol/L.

图4 Cy-2与不同浓度肼(0～10 μmol/L)反应后，在808 nm处光声图像

图5 探针P(808)与肼浓度呈线性关系

2.2 Cy-2对肼的检测选择性研究

为探究Cy-2对肼的选择性，利用紫外-可见光谱和光声成像技术，共同验证探针Cy-2对肼的识别特异性.向Cy-2(10 μmol/L)的甲醇溶液中，分别加入 100 μmol/L的N2H4、NO3-、Cl-、Br-、SO42-、CH3COO-、NH4+、Na+、K+、Ag+、Zn2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Hg2+和Pb2+，待反应5 min后，检测各反应溶液的吸收光谱，结果如图6.由图6可见，只有加入肼的溶液的吸收峰位置发生显著的蓝移，在808 nm处的吸收峰消失，在550 nm处出现新的吸收峰，而其他溶液的吸收光谱几乎没有变化.如图7所示，只有加入肼的Cy-2溶液颜色由原来的绿色变成了红色，D(808)/D(550)比值降低；而加入其他离子的溶液颜色及D(808)/D(550)比值均无明显变化，表明Cy-2对肼检测的特异性很好.

图6 Cy-2与100 μmol/L的肼和其他离子作用的吸收光图谱

1为Cy-2；2为SO42-；3为NO3-；4为Cl-；5为Br-；6为CH3COO-；7为NH4+；8为Na+；9为K+；10为Ag+；11为Zn2+；12为Hg2+；13为Mg2+；14为Cu2+；15为Mn2+；16为Pb2+；17为N2H4

随后，利用光声成像来研究Cy-2对肼的识别特异性.向Cy-2(10 μmol/L)的甲醇溶液中，分别加入100 μmol/L的N2H4、NO3-、Cl-、Br-、SO42-、CH3COO-、NH4+、Na+、K+、Ag+、Zn2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Hg2+和Pb2+，待反应5 min后，测得各反应液的光声信号强度.如图8和图9，只有加入肼溶液的探针在808 nm处的光声信号强度下降，而其他离子的加入都不会引起明显变化，实验结果再次表明Cy-2对肼具有很好的选择性.

图8 Cy- 2分别与肼、其他离子(100 μmol/L)作用后在808 nm处光声信号变化

1为Cy-2；2为SO42-；3为NO3-；4为Cl-；5为Br-；6为CH3COO-；7为NH4+；8为Na+；9为K+；10为Ag+；11为Zn2+；12为Hg2+；13为Mg2+；14为Cu2+；15为Mn2+；16为Pb2+；17为N2H4

结 语

本研究设计并合成了一种以花菁类染料为母体的光声分子探针Cy-2，实现了肼的光声检测.该探针在波长808 nm处具有较强的光声信号.当探针分子与肼作用后，随着溶液中肼浓度的增高，分子探针在808 nm处的光密度显著下降，而550 nm处的光密度明显升高，且在一定浓度范围内(0～10 μmol/L)，D(808)/D(550)与肼浓度具有良好的线性关系.同时，新型分子探针808 nm处的光声信号强度也随着肼浓度增加而降低，在肼浓度为0～10 μmol/L内，P(808)与肼浓度呈良好的线性关系，肼检测限为0.50 μmol/L.该探针合成方法简单，并能够对肼实现快速高效的光声检测，有望用于在体或深层组织肼的检测.

致 谢：感谢深圳大学丽湖校区测试中心的支持！