外泌体调控细胞自噬相关信号通路的研究进展

胡明智，杨国安，孙晓林△

细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是由原核生物、真核生物细胞释放的膜性小囊泡，根据分子大小及分泌方式的不同可将细胞外囊泡分为外泌体、膜微粒及凋亡小体3种类型。其中,外泌体携带多种蛋白质、脂类和RNA等生物活性物质，在细胞间信号传递中起到重要作用，并广泛参与细胞凋亡、炎症反应、免疫调节等多种病理生理过程［1-2］。自噬是细胞内广泛存在的一种降解机制，其可通过溶酶体途径清除细胞内受损的蛋白质和细胞器，维持细胞稳态。研究发现，外泌体的生成与自噬之间有着共同的分子机制，两者存在实质性的交互通信。外泌体可通过调控自噬参与心肌缺血再灌注损伤［3］、糖尿病肾病［4］、骨关节炎［5］等多种疾病的发生发展，外泌体与自噬之间的关系已成为目前的研究热点［6］。本文就外泌体与自噬的关系及其参与的信号通路作一综述，为其临床研究及应用提供参考。

1 外泌体的概述

外泌体由多泡体的腔膜衍生而来，为直径30～100 nm的囊泡样结构，由磷脂双分子层包裹，当多泡体与细胞膜融合时，释放到细胞外环境。外泌体包含丰富的蛋白质，如黏附分子、膜转运分子、细胞骨架分子、热休克蛋白、信号转导蛋白、趋化因子、蛋白酶和细胞特异性抗原等［7］。外泌体中CD9、CD81、CD63等跨膜蛋白以及热休克蛋白70（heat shock proteins 70，HSP70）均存在高表达［8］。此外，外泌体还包含mRNA、miRNA、长链非编码RNA（long noncoding RNA，LncRNA）等携带遗传信息的相关物质。外泌体富含胆固醇和鞘磷脂，可以通过受体或非受体介导的内吞作用来调节靶细胞的稳态［9］。多数类型的细胞都会释放外泌体，外泌体可存在于血浆、母乳、唾液、尿液等体液中。总之，外泌体可以通过在细胞间传递其包含的蛋白质、脂质或核酸，参与细胞凋亡、纤维化、炎症免疫反应以及自噬等病理生理过程［7］。

2 自噬的概述

1962年，Ashford等［10］在研究溶酶体内部物质时发现了自噬现象。自噬是细胞在缺氧及营养缺乏等环境下，通过自我吞噬可溶性物质或细胞器，将其传递到溶酶体进行降解，以维持细胞生命活动的过程［11］。自噬在维持机体的内环境稳态方面发挥着重要作用。目前自噬已成为细胞生物学研究中颇受关注的领域之一。自噬异常可以诱导肿瘤［12］、自身免疫性疾病［13］、神经退行性疾病［14］、炎症［15］、肝纤维化［16］以及缺血再灌注损伤［17］等多种疾病的发生发展。细胞自噬依据底物进入溶酶体方式的不同可分为微自噬、巨自噬和分子伴侣介导的自噬。微自噬是指溶酶体直接吞噬细胞质成分的过程［18］。巨自噬是指自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，将其所包含的受损细胞器等细胞内容物降解的过程［19］。分子伴侣介导的自噬不同于其他两种自噬，是指经分子伴侣选择的胞质蛋白靶向运送至溶酶体表面，穿过溶酶体膜在溶酶体内被降解的过程［20］。自噬相关基因（autophagy related gene，ATG）、自噬相关蛋白Beclin-1和微管相关蛋白轻链3-Ⅱ（microtubuleassociated protein light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）等在自噬过程中发挥调控作用［21］。

3 外泌体调控自噬的作用

研究表明，外泌体中包含的miRNA与自噬调控密切相关，如 miR-181-5p［22］、miR-30d-5p［23］、miR-221/222［24］等。Cai等［25］在研究辐射诱导的旁观者效应中发现，经X线照射的星形胶质细胞可以提取出含有大量miR-7的外泌体，这些富含miR-7的外泌体通过靶向抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，促进肺组织细胞的自噬。间充质干细胞来源的外泌体在调控自噬方面的研究也相继被报道。Wu等［5］研究发现，髌下脂肪间充质干细胞来源的外泌体中富含miR-100-5p，miR-100-5p通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的激活，诱导小鼠软骨细胞的自噬，从而维持关节软骨内环境稳定，改善骨关节炎小鼠的步态异常。Jin等［4］在研究脂肪间充质干细胞来源的外泌体（adipose derived stem cells-exosome，ADSCs-Exo）对糖尿病肾病的治疗作用中发现，ADSCs-Exo的miR-486通过靶向抑制糖尿病肾病小鼠足细胞中细胞信号转导分子（Smad）1的表达，从而抑制mTOR的激活，促进自噬，减轻糖尿病肾病小鼠的足细胞损伤。Ebrahim等［26］研究发现，骨髓间充质干细胞来源的外泌体可以通过调节mTOR信号通路诱导自噬，使自噬标志蛋白LC3和Beclin-1的表达水平显著提高，肾组织中mTOR和纤维化标志物转化生长因子（TGF）-β1以及纤维蛋白的表达水平显著降低，这一研究也说明外泌体可以改善糖尿病肾病大鼠的肾组织损伤。以上研究均提示外泌体可通过传递特定的miRNA调控靶细胞自噬，进而在多种生理病理过程中发挥其重要作用。

4 外泌体调控自噬的相关信号通路

4.1 mTOR信号通路 mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，即为雷帕霉素（Rapamycin）的靶蛋白，包括mTORC1和mTORC2两种形式的复合体。mTOR被认为是自噬的中心“看门人”，能够整合3种信号：（1）营养信号，如生长因子或氨基酸。（2）能量信号，如细胞内的腺苷一磷酸（AMP）/腺苷三磷酸（ATP）比率。（3）应激信号，如缺氧或DNA损伤等。目前对mTORC1的研究报道较多，在营养丰富的条件下，mTORC1与ULK1-ATG13-FIP200-ATG101复合物结合，使ULK1和ATG13磷酸化，抑制细胞自噬。在营养缺乏条件下或经mTOR抑制剂处理后，mTORC1从这个巨型复合物中解离，而ULK1、ATG13和FIP200被激活，最终诱导自噬体的形成［27］。由此可见，mTORC1是自噬的负调控因子，活化后可抑制细胞自噬的发生。也有研究发现，同时抑制mTORC1和mTORC2的活性，可能会增强对自噬的诱导［28］。Gu等［29］研究发现，脐带间充质干细胞来源的外泌体

可通过调控AMP活化蛋白激酶（AMPK）/mTOR信号通路，促进心肌细胞的自噬，减轻心肌细胞凋亡，从而改善病毒性心肌炎的心肌损伤情况。Liu等［30］研究发现，雷公藤红素可通过ROS/JNK和Akt/mTOR信号通路介导神经胶质瘤细胞的自噬和凋亡。这些结果均提示mTOR信号通路是调控细胞自噬的重要相关通路。

4.1.1 磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt/mTOR信号通路 PI3K/Akt/mTOR信号通路是重要的细胞内信号转导通路，在细胞增殖、生长、存活、囊泡运输、葡萄糖转运、细胞骨架组织、肿瘤发生发展等方面发挥重要作用；其同时也是调控自噬的经典通路，抑制此信号通路可促进自噬的发生。PI3K根据其结构和功能可分为3类，其中ⅠA型PI3K与人类癌症的关系最为密切，也是研究最广泛的。ⅠA型PI3K是由一个调节亚基（p85）和一个催化亚基（p110）组成的异二聚体。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）和胰岛素等都能激活PI3K通路，这些因子激活受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases，RTK），募集PI3K的p85亚基到活化的受体后，使PI3K磷酸化，并将PIP2转化为PIP3。PIP3与含有PH结构域的磷酸肌醇依赖激酶1（phosphoinositide-dependent kinase 1，PDK1）和蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）识别并结合，通过PDK1使Akt蛋白的苏氨酸308位点磷酸化，活化的Akt激活mTORC1，从而抑制自噬。活化的Akt同时也可以磷酸化TSC1/TSC2蛋白复合体，使小GTP酶Rheb（Ras homologue enriched in brain，Rheb）富集，活化mTORC1，抑制自噬［31-32］。Liu等［33］研究发现，外泌体可通过PI3K/Akt/mTOR通路下调自噬标志蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1的表达，上调p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR的表达，从而抑制自噬，减少心肌细胞凋亡，并推测其机制可能与外泌体中miRNA或细胞因子的富集有关。Song等［34］研究发现，外泌体中的miR-7-5p可以通过调控EGFR的表达，抑制Akt/mTOR信号通路，从而诱导自噬的发生。在PI3K/Akt/mTOR信号通路中，PIP2转化为PIP3这一过程受到第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（phosphatease and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）的负向调控，进而抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路活化［35］。Zhou等［36］研究发现，PTEN是miR-19a-3p的靶基因，PTEN 3′UTR端上有3个miR-19a-3p结合位点，外泌体中miR-19a-3p通过靶向PTEN，调控Akt/mTOR信号通路，抑制小胶质细胞的自噬。

4.1.2 AMPK/mTOR信号通路 AMPK是一种细胞能量状态的感受器，在真核细胞中表现为含有催化a亚基和调控b和g亚基的杂三聚体复合物。在哺乳动物中，当AMP/ATP或腺苷二磷酸（ADP）/ATP比值增加或细胞能量状态被破坏时就会激活AMPK［37］。AMPK主要通过抑制mTORC1促进自噬。活化的AMPK可以直接磷酸化TSC2和mTORC1的结合亚基 Raptor，抑制 mTORC1 活化，从而诱导自噬［38］。Wen等［39］研究发现，miR-185可能通过调控AMPK/mTOR信号通路，抑制帕金森病多巴胺神经元细胞的自噬和凋亡。Liu等［3］研究发现，间充质干细胞来源的外泌体通过激活AMPK/mTOR和Akt/mTOR信号通路诱导心肌细胞自噬，从而减轻心肌缺血再灌注损伤。该研究也指出需要进一步的实验来确定外泌体中RNA、miRNA或相关蛋白在心肌缺血再灌注损伤中的治疗作用机制。

4.2 Toll样受体信号通路 Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）作为模式识别受体中的一个主要家族，是一类由胞外、跨膜和胞内信号域组成的跨膜蛋白。目前已经发现11种与人类相关的TLRs，其中关于TLR4的研究较多。TLR的胞外结构域具有富含亮氨酸的重复序列，并负责结合病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），在免疫反应中发挥重要作用，现在也有越来越多的研究将TLR和自噬联系起来。TLR与配体识别后通过募集髓样分化蛋白88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）和β-干扰素TIR结构域衔接蛋白开启下游信号转导，除TLR3外的其他TLR均通过募集MyD88介导信号通路的激活，MyD88通过一系列信号转导激活核因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）。NF-κB可以通过直接诱导Beclin-1、ATG5、LC3等自噬相关蛋白的表达促进自噬，也可以通过增加A20、Bcl-2等自噬抑制因子的表达下调自噬。有研究指出NF-κB可以通过抑制PTEN的表达激活mTOR通路，从而抑制自噬的发生［40］。TLR4下游可能存在自噬相关信号，TLR4启动募集MyD88后激活TRAF6，TRAF6多泛素化激活Beclin-1，促进自噬过程，或激活AMPK通路，从而抑制mTORC1，诱导自噬［41-42］。Wen等［43］研究发现，miR-421通过靶向结合MyD88基因，抑制TLR/MYD88通路激活，从而减少癫痫小鼠海马神经元的凋亡和自噬。Zhang等［44］研究发现，胃癌细胞来源的外泌体表达的高迁移率族蛋白-1（high mobility group box-1，HMGB1）通过与TLR4相互作用激活NF-κB通路，诱导中性粒细胞自噬，最终促进胃癌细胞的增殖和迁移。以上多项研究已经证实外泌体中的miRNA可以调控细胞自噬，也有研究发现外泌体携带的蛋白质可以通过TLR信号通路调控自噬。

4.3 STAT3/Bcl-2信号通路 越来越多的研究表明，STAT3作为信号转导及转录激活因子（signal transducers and activators of transcription，STAT）家族中的一员，在自噬体的形成到成熟的过程中，参与了自噬的调控。根据STAT3在细胞中的定位不同，其对自噬的调控作用也不同。细胞核内的STAT3通过促进自噬负调控因子Bcl-2、Bcl2L1和MCL1的表达来抑制自噬；磷酸化的STAT3通过调节凋亡蛋白BNIP3的表达，发挥促自噬功能。胞质中的STAT3通过直接抑制真核生物翻译起始因子2-α激酶2（eukaryotic translation initiation factor 2-α kinase 2，EIF2AK2）的活性来抑制自噬；胞质中的STAT3磷酸化后，促使自噬相关蛋白FOXO1和FOXO3去磷酸化，并进入细胞核，上调ULK2、Beclin-1、ATG12等多个自噬相关基因的表达，促进自噬［45］。Li等［46］研究发现，miR-519a可通过靶向抑制STAT3/Bcl-2信号通路，促进胶质母细胞瘤细胞自噬，并增强其化疗敏感性。有研究表明，ADSCs-Exo中的miR-181-5p可以下调STAT3和Bcl-2的表达，并激活小鼠肝星状细胞自噬，发挥其抗纤维化的作用，提示含有miRNA的外泌体可以通过STAT3/Bcl-2信号通路调控自噬［22］。

5 小结与展望

外泌体调控细胞自噬的能力是通过转移活性物质（如miRNA），激活细胞内自噬相关的信号通路来实现的。miRNA通过靶向自噬信号通路中的部分信号分子和自噬相关基因的表达来调控自噬［47］。另有研究发现多泡体作为外泌体的前体，可通过自噬被降解，从而减少外泌体的释放［48］，其降解机制可能会成为未来的研究热点。总之，外泌体调控自噬在自身免疫性疾病［49］、骨关节炎［5］、糖尿病肾病［26］、心肌缺血再灌注损伤［3］、神经退行性疾病［50］的治疗中表现出临床应用前景,但目前关于外泌体调控自噬的研究尚处于基础实验阶段，且以miRNA调控自噬的研究报道较多，而外泌体中包含的其他活性物质对自噬调控的研究较少，亦有更多的通路机制有待发掘。