黄酮类化合物抗卵巢癌化疗耐药的作用进展

林世鑫，高军

在女性生殖系统肿瘤中，卵巢癌的病死率一直居高不下。2018年，全球约有30万例新发卵巢癌，约18万例死于卵巢癌［1］。尽管近些年来生物治疗、免疫治疗等新型的治疗手段，尤其是聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶（Poly ADP-ribose Polymerase，PARP）抑制剂的使用，使卵巢癌的治疗有了更多的选择，但手术结合化疗仍然是卵巢癌的一线治疗方案。虽然多数卵巢癌对铂类敏感，一线治疗反应率高，但在晚期患者中，约75%会因耐药导致复发、转移，进而影响患者生存［2］。因此，如何克服卵巢癌的耐药，尤其是铂类耐药，是横亘在攻克卵巢癌道路上的诸多顽石之一。

黄酮类化合物是广泛存在于多种天然植物中的多酚类物质。我国传统医学中的中草药如银杏叶、淫羊藿、黄芩等均含有黄酮类化合物。依据其结构不同，可将黄酮类化合物分为黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮（黄烷酮类）、查尔酮类、花色素类等。既往研究认为黄酮类化合物的抗肿瘤作用主要体现在抗细胞增殖、诱导细胞凋亡等方面［3-4］。黄酮类化合物在改善卵巢癌耐药方面有一定作用。本文从靶前、靶标、靶后及靶外耐药等方面就近年来黄酮类化合物在改善卵巢癌化疗耐药作用中的相关研究进展进行综述。

1 改善靶前耐药

化疗药物进入肿瘤细胞依赖膜表面的各种转运通道，随后在细胞内经过化学反应形成亲核性物质，进入细胞核或线粒体产生作用。在耐药性卵巢癌细胞中，通常伴有膜转运蛋白的改变，即为靶前耐药最常见机制。

1.1 铜转运蛋白 铜转运蛋白1（copper transport protein 1，CTR1）与顺铂的跨膜运输关系改变了既往认为顺铂以被动扩散的形式进入细胞的观点。研究发现铜离子结合CTR1后，顺铂对细胞的毒性明显下降，表明顺铂与铜离子存在竞争性抑制［5］。Wang等［6］用黄烷类物质表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）对顺铂耐药卵巢癌细胞株OVCAR-3进行了体内外实验，发现EGCG可通过抑制顺铂诱导的CTR1降解而增强卵巢癌细胞的铂敏感性。另有实验表明，茶黄素可以上调卵巢癌细胞中的CTR1水平，并降低胞内谷胱甘肽的浓度，而后者为亲核性物质，在细胞内充当铂隔离剂，诱发卵巢癌耐药［7］。

1.2 抑制P-糖蛋白（P-gp）过表达 除了CTR1与铂摄取的关系密切外，P-gp在卵巢癌的耐药过程中同样值得关注。其作用类似于药物泵，能将肿瘤细胞内的药物分子源源不断泵出细胞外，从而使肿瘤产生耐药。柚皮甙（Naringin）是一种主要存在于芸香科植物柚、橙、橘的果实及果皮中的二氢黄酮，也是中药陈皮的主要药理活性物质。Zhu等［8］以10、20和40 μmol/L的柚皮甙处理人卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP后，发现核因子（NF）-κB和P-gp的基因和蛋白表达随柚皮苷剂量上升而降低；在过表达NF-κB的细胞中，P-gp表达显著升高，而当NF-κB沉默时P-gp表达显著降低，表明柚皮甙能抑制NF-κB信号通路介导的P-gp过表达，从而逆转卵巢癌的靶前化疗耐药。

2 对抗靶标耐药

铂类等化疗药物可进入胞内与DNA形成加合物，产生细胞生物学信号，诱发细胞凋亡。在化疗耐药的肿瘤细胞中，化疗药物与DNA形成的加合物如Pt-DNA等含量减少，继而识别加合物的效应滞后甚至缺失，导致DNA修复途径异常，此为主要的靶标耐药机制［9］。而卵巢癌细胞针对顺铂等化疗药物引起的DNA损伤通常由核苷酸切除修复来完成［10］。

槲皮素（Quercetin）是一种黄酮醇类化合物，在中药柴胡、桑叶中含量丰富，其抗肿瘤作用得到广泛的研究与认可。有研究将槲皮素与单功能铂配合物（monofunctional platinum-containing）联合处理顺铂耐药卵巢癌细胞株A2780/Cisr和A2780/ZD043R后，发现Pt-DNA加合物水平明显上升［11］，认为加合物水平的上升与单功能铂配合物的活性相关，而与槲皮素的剂量无关，然而单独应用单功能铂配合物时，并不能观察到加合物水平的上升。提示槲皮素在此过程中仅具有“催化效应”。

中药黄芩蕴含丰富的黄芩苷（Baicalin），后者是目前临床研究较为广泛的黄酮类物质。将黄芩苷与顺铂共同处理卵巢癌细胞OVCAR-3后，肿瘤细胞的生长受到明显抑制，同时Pt-DNA加合物含量较单用顺铂处理组显著增加，且光谱分析进一步发现黄芩苷与顺铂形成了配合物，表明黄芩苷有助于顺铂与DNA的结合，增强顺铂对卵巢癌的作用［12］。进一步研究发现，在黄芩苷与顺铂联合作用后，限制性核苷酸内切酶BamHⅠ对pBR322质粒DNA的消化受到抑制，说明黄芩苷能抑制卵巢癌细胞响应的顺铂损伤DNA后的核苷酸切除修复作用，以对抗靶标耐药。

3 逆转靶后耐药

化疗药物在细胞内引起DNA损伤后，促使细胞凋亡、坏死等生物学行为，达到治疗作用。其中涉及细胞凋亡等行为的信号转导通路复杂多变，肿瘤细胞正是通过改变这些信号通路实现“紧急自救”，从而产生靶后耐药。

3.1 p53基因失活和细胞周期阻滞 p53基因的失活与肿瘤的发生关系密切，在卵巢癌细胞中，野生型p53与细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂家族p21、p27等共同组成细胞周期G1检查点，使DNA受损的肿瘤细胞停留在G1期，发挥抑癌作用。当卵巢癌细胞产生耐药性后，p53将发生不同程度的失活，同时抑制下游促凋亡信号通路ERK1/2/p53/PUMA的活化［13-14］。

二氢杨梅素（Dihydromyricetin，DHM）是二氢黄酮类药物，是长寿藤的主要活性物质，后者在我国两湖地区广泛种植，其叶可作茶饮。一项体外实验表明，DHM可以抑制卵巢癌细胞中p53介导的凋亡抑制蛋白Survivin的表达，从而逆转卵巢癌对紫杉醇和阿霉素的耐药性，同时也发现DHM以剂量依赖的方式提高p53及其磷酸化水平［15］，表明DHM诱导的卵巢癌细胞的凋亡是以激活p53、抑制Survivin的途径实现的。

茶 黄 素 -3，3-没 食 子 酸（Theaflavin-3，3′-digallate，TF3）是红茶中的儿茶素物质，属于黄烷类化合物。Gao等［16］的研究表明，TF3能上调Fas/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspasae）-8信号通路途径而促进外源性凋亡，同时促进p27表达而使卵巢癌细胞发生G0/G1期阻滞。Halder等［17］研究发现TF3亦能上调p19、p21两种细胞周期蛋白，诱发G0/G1期阻滞，提示TF3可能靶向作用于细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂家族而调节细胞周期。在另一项对茶黄素单体TF2和TF2b的研究同样发现茶黄素通过ATM/Chk/p53途径诱导DNA损伤的现象［18］。值得注意的是，在Gao等［16］的研究中，TF3并未影响p53蛋白的表达，表明p53并不是TF3诱导凋亡的先决条件。但在p53缺失或者突变的耐药性卵巢癌细胞中，使用TF3仍然能够促进肿瘤细胞凋亡，发挥抗癌作用。

3.2 抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）途径过表达 PI3Ks信号参与增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节，其与下游的AKT共同组成经典的PI3K/AKT途径，该途径的异常活化与卵巢癌等恶性肿瘤关系密切。磷酸化后AKT可抑制B淋巴细胞瘤-2相关促凋亡蛋白（BAD）与重组人B细胞淋巴瘤因子2-XL（Bcl-XL）的结合而减少细胞凋亡发生，并促进细胞增殖，且该通路受到抑癌基因PTEN的负性调节［19］。近来有证据表明，AKT的过表达可以显著降低卵巢癌细胞对顺铂的敏感性，是卵巢癌靶后耐药的重要机制之一［20］。

紫铆查尔酮（Butein）是从紫铆树中提取的查尔酮类化合物。有研究显示，在耐紫杉醇卵巢癌细胞SKOV3/PAX中，紫铆查尔酮可以显著降低PI3K的磷酸化水平而引起凋亡起始蛋白Caspase-8/9的转录，诱导细胞凋亡，改善紫杉醇耐药［21］。Liu等［22］采用人工合成的黄酮类衍生物RY-2f干预顺铂耐药株A2780/CDD，同样发现PI3K/AKT/mTOR通路的抑制，更证明了RY-2f上调了该通路的关键负性调控组件PTEN的表达，增强了癌细胞对顺铂的敏感性。此外在蜂胶黄酮［23］、O-甲基化异黄酮［24］等相关研究中，均能观察到PI3K/AKT途径的失活而引起的卵巢癌细胞的凋亡。

3.3 抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路 MAPK是一组能接收细胞外刺激的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，该通路为典型的三级激酶酶促反应通路，目前研究较多的MAPK家族成员有c-Jun氨基末端激酶（JNK）、p38蛋白、细胞外调节蛋白激酶（ERK）3种。Lengyel等［25］发现高度活化的MAPK通路可促进肿瘤细胞的增殖侵袭，当MAPK通路受到抑制时则可改善肿瘤耐药，尤其是抑制p38蛋白的磷酸化后，可逆转卵巢癌细胞对紫杉醇的耐药性。

山萘酚（Kaempferol）是一种主要来源于山萘的黄酮类化合物，最近被证实可通过ERK/JNK/CHOP途径上调死亡结构域蛋白（death domain-associated protein，DR）4和DR5的表达，使耐药性卵巢癌细胞对肿瘤坏死因子凋亡相关配体（NF-related apoptosis inducingligand，TRAIL）诱导的细胞凋亡敏感［26］。另有研究表明，槲皮素能使MAPK/ERK通路失活，并可以诱导细胞周期蛋白D1下调和p21的上调，阻滞细胞周期，增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性［27］。Yan等［28］采用黄芩苷处理卵巢癌细胞株后发现了基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）的表达下降并抑制了p38-MAPK的活化，表明黄芩苷对卵巢癌的侵袭具有抑制作用。结合Lengyel等［25］的研究结果，推测黄芩苷应能逆转卵巢癌的紫杉醇耐药性，但尚未见研究报道佐证。

4 靶外耐药

肿瘤细胞产生耐药性的途径除了改变受药物影响的各种分子信号外，还可以作用于非药物靶向的信号通路，使之发生改变而产生靶外耐药。

4.1 抑制细胞自噬 细胞自噬和细胞凋亡一样，是细胞程序化死亡方式之一。细胞自噬由自噬溶酶体发动，降解并回收自身产物用于细胞增殖。在肿瘤细胞生长早期，自噬可一定程度上抑制肿瘤细胞的增殖；在肿瘤形成晚期，自噬却可以降解受损肿瘤细胞以促进其继续生长，称为保护性自噬。近年来有研究表明在细胞产生耐药的过程中伴有自噬蛋白的表达上调［29］，而抑制自噬则可以逆转耐药［30］。

木犀草素（Luteolin）是一种天然的黄酮类化合物，在中药野菊花中含量丰富。已有研究证明其对顺铂耐药卵巢癌具有诱导凋亡、逆转耐药的作用［31］。在经过木犀草素处理后的顺铂耐药卵巢癌细胞株中，自噬标志物微管相关蛋白l轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）的表达明显降低，同时原本对顺铂耐药的细胞株恢复了对顺铂的敏感性［31］。当使用小干扰RNA（siRNA）沉默PARP-1后，可加强木犀草素对卵巢癌的活性抑制，并进一步降低LC3-Ⅱ的表达以恢复顺铂敏感性［32］。此项研究表明，在针对铂耐药型晚期复发卵巢患者的PARP-1抑制剂治疗同时联合使用木犀草素恢复铂敏感或许是一个值得研究的方案。4.2 逆转上皮-间质转化（EMT） EMT是肿瘤细胞侵袭转移的重要机制。研究表明，EMT可以促进肿瘤细胞的耐药，其机制可能与诱导胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）的高表达、白细胞介素（IL）-6的异常活化、Wnt/β-catenin通路上调等有关［33-34］。研究发现木犀草素在非细胞毒性剂量（45.6 mmol/L）下抑制EMT，并使耐药性卵巢癌恢复对紫杉醇的敏感性［35］。其机制是通过降低局部黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）和ERK的磷酸化，减少p65的核易位而逆转EMT，进而逆转耐药。此外，研究人员还发现山萘酚能降低肺癌细胞的EMT水平，恢复耐药肺癌细胞对化疗药培美曲塞的敏感性［36］。但尚缺乏山萘酚与卵巢癌的相关研究。

4.3 肿瘤干细胞（CSCs） 随着对肿瘤增殖研究的深入，研究者提出了CSCs概念。在肿瘤组织中总有部分细胞一直保持着自我更新能力，成为肿瘤异质性、耐药性的来源。而维持这种高致瘤性、强耐药性的干细胞特性的机制复杂，涉及多种分子信号的传递，如Rho蛋白、长链非编码RNA（LncRNA）、Musashi蛋白、ATP结合盒式蛋白（ATP-binding cassette transporter，ABC）等［37］。CSCs产生耐药的机制亦是当前研究热点。

自杨梅叶中提取的花色素化合物杨梅叶原花青素（Chinese bayberry leaf proanthocyanidins，BLPs）能通过抑制β-连环蛋白（β-catenin），G1/S-特异性周期蛋白-D1（cyclin D1）和c-Myc蛋白的表达来靶向Wnt/β-catenin途径，从而抑制耐药株OVCAR-3中CSCs的自我更新能力，减弱其干细胞特性，逆转耐药［38］。Su等［39］发现一种新型的查尔酮衍生物甲氧苯基查尔酮能通过诱导肿瘤干细胞的凋亡而使耐顺铂的上皮性卵巢癌恢复对顺铂的敏感，逆转耐药。

5 小结与展望

目前黄酮类化合物改善卵巢癌耐药的研究集中于卵巢癌靶后响应途径上，尤其对p53蛋白及其他细胞周期蛋白“再激活”的研究已经有了进展，但不同类别的黄酮类化合物启动细胞周期蛋白磷酸化的信号转导途径并不完全一致。这表明目前研究仍需反复验证，黄酮类化合物诱导耐药卵巢癌细胞周期阻滞的信号通路是否存在唯一性，抑或是其作用机制因不同黄酮类化合物的结构不同而产生不同作用，值得继续研究与探讨。其次，CTR1对顺铂的跨膜转运作用在卵巢癌中得到证实，且发现部分黄酮类化合物能抑制CTR1的降解并上调其在卵巢癌中表达，从而逆转耐药。但CTR1影响肿瘤耐药，尤其是卵巢癌耐药的研究刚刚开始，尚未见到其具体作用机制的报道，需要更多的实验佐证以及更多的数据支持。