葛仙米藻胆蛋白粗提物、藻蓝蛋白和藻红蛋白的体外抗氧化活性比较研究

余佳，王生，许文琦，张瑞华，*，王玉兰，*

（1.湖南炎帝生物工程有限公司湖南省微藻生物工程技术研究中心，湖南株洲412007；2.中国医药工业研究总院，上海医药工业研究院药物与制药工艺国家重点实验室，上海200437）

葛仙米（Nostoc sphaeroids），学名球状念珠藻，属蓝藻门[1]（Nostocaceae）念珠藻属（Nostoc.）[2-6]，是一种药食同源的经济蓝藻，在我国古代就有其食用和药用的历史记载，长期以来被作为有效的中草药资源和膳食补充剂。《药性考》中称葛仙米具有“清神解热，痰火能疗”的作用，《纲目拾遗》中则记载葛仙米具有“解热，清膈，利肠胃”的作用，《陕西中草药》称其在“清热收敛，益气明目，治烫火伤，夜盲症”有很好的功效[7]。野生葛仙米鲜品富含7%～8%的藻胆蛋白，主要为藻蓝蛋白和藻红蛋白，其中藻蓝蛋白是藻红蛋白的3.5 倍左右[8]；野生葛仙米干品的总蛋白含量高达50%以上，含有17 种氨基酸，其中8 种人体必需氨基酸含量达44.6%[9]。野生葛仙米较为罕见，早年主要分布在湖北鹤峰、湖南张家界等地区的农田中，但由于农药的滥用，野生葛仙米大量减产，已濒临灭绝[10-11]。现在市场上主要为人工养殖的葛仙米，其干品蛋白质的含量不如野生葛仙米丰富，约在32%以上[12]。人工养殖的葛仙米已于2018 年被国家卫生健康委员会批复可作为新食品原料使用。

现代研究表明，葛仙米蛋白具有较好的调节免疫、抗炎、抗氧化、抗紫外损伤、抗肿瘤等功能[13]。在抗氧化方面，周站平等研究发现藻胆蛋白具有较好的抗氧化作用，藻胆蛋白清除自由基主要是由藻胆色素完成，在光照和黑暗条件下，藻胆蛋白具有产生和清除自由基的双重功能，而通过用十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、脲及碱处理对藻胆蛋白进行变性，其产生自由基能力消失，清除自由基能力显著增强[14]。陈德文采用化学发光法研究发现葛仙米藻红蛋白对羟基自由基、超氧阴离子自由基、过氧化氢自由基都有明显的清除作用，表现出良好的抗氧化能力[15]。研究显示葛仙米藻蓝蛋白同样具有抗氧化能力，体外研究显示藻蓝蛋白具有清除羟基自由基和过氧化氢自由基的能力，体内研究揭示藻蓝蛋白可以抑制CCl4或 2，2-盐酸脒基丙烷 （2，2'-azobis [2-methylpropionamidine]dihydrochloride，AAPH）引起的肝脏线粒体脂质过氧化物的生成[16]。

已有研究人员对野生葛仙米藻胆蛋白、藻红蛋白或藻蓝蛋白的抗氧化作用进行了研究，但是，对由人工养殖的葛仙米提取纯化得到的藻胆蛋白粗提物、藻红蛋白、藻蓝蛋白抗氧化性能，以及这三者的活性对比研究鲜有报道。人工养殖的葛仙米蛋白是否也具有相类似的性能，不得而知。本研究前期通过微波辅助法[16]提取了人工养殖的葛仙米的藻胆蛋白粗提物，并将其纯化得到藻蓝蛋白和藻红蛋白，并对这三者进行抗氧化活性对比研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

采用文献[12]的方法制得的葛仙米藻胆蛋白粗提物母液、葛仙米藻红蛋白母液（纯度为95%）、葛仙米藻蓝蛋白母液（纯度为97%）：湖南炎帝生物工程有限公司自制。

邻苯三酚：Sigma-Aldrich 公司；Tris-HCl 缓冲液（pH 8.8）：Solarbio 公司；2-硫代巴比妥酸、2-D-脱氧核糖、硫酸亚铁、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、过氧化氢、苯甲酸、抗坏血酸及其他试剂：国药集团。

1.2 仪器与设备

FORMA 371 STERI-CYCL 细胞二氧化碳培养箱、Varioskan Flash 酶标仪：赛默飞世尔科技公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白的配制

藻蓝蛋白配制：藻蓝蛋白母液最大浓度为4.94 mg/mL，依次用液（phosphate buffer saline，PBS）梯度稀释成 1、5、25、50、125、250、500、1 000 μg/mL。

藻红蛋白配制：藻红蛋白母液最大浓度为1.08 mg/mL，依次用 PBS 梯度稀释成 1、5、25、50、125、250、500、1 000 μg/mL。

藻胆蛋白粗提物配制：藻胆蛋白粗提物母液最大浓度为4.37 mg/mL，依次用磷酸缓冲盐溶液PBS 梯度稀释成 1、5、25、50、125、250、500、1 000 μg/mL。

1.3.2 清除羟基自由基能力测定

取8 支具塞试管，分别加入0.2 mL 10 mmol/L 的FeSO4-EDTA 混合液，0.2 mL 20 mmol/L 的 2-D-脱氧核糖溶液，0.2 mL 不同浓度受试样品，并用PBS 补充至1.8 mL，最后加入 0.2 mL 10 mmol/L 的过氧化氢，37 ℃水浴加热反应1 h，以苯甲酸（1 mg/mL）和抗坏血酸（1 mg/mL）为对照，加入1 mL 10%的三氯乙酸终止反应，再加入1 mL 1%的硫代巴比妥酸，混匀后沸水浴中加热10 min，冷却后离心取上清液，于532 nm 处测定吸光度。

羟基自由基的清除率/%=（A对照-A样品）/A对照×100

1.3.3 清除超氧阴离子自由基能力测定

采用邻苯三酚自氧化的方法进行清除超氧阴离子自由基能力的测定。

邻苯三酚自氧化反应速度的测定：测定试验在25 ℃下进行，向具塞试管中加入1.5 mL Tris-HCl-EDTA 缓冲液（pH 8.2）和 0.1 mL 6 mmol/L 的邻苯三酚（对照组以10 mmol/L 盐酸代替邻苯三酚），用去离子水补足至3 mL，迅速混匀后，以对照管调零，在波长420 nm 处每0.5 min 测定一次吸光度，共测4 min，以吸光度和时间作图，根据线性变化部分的斜率求出自氧化反应速度（ΔOD420/min）；适当改变邻苯三酚的用量，使自氧化速度为0.02ΔOD420/min 左右。

受试蛋白对邻苯三酚自氧化反应速度的影响：测定过程与邻苯三酚自氧化相同，在反应体系中另加入0.1 mL 不同浓度的受试蛋白，适当调整样品的浓度，使抑制下的氧化反应速度在0.007ΔOD420/min ～0.013ΔOD420/min。

超氧阴离子清除率/%=[自氧化（ΔOD420/min）-样品管（ΔOD420/min）]/自氧化（ΔOD420/min）×100

1.3.4 对过氧化氢诱导的脂质过氧化的影响

取小鼠的肝组织，用冷生理盐水洗净后冰浴下匀浆，制成1%悬浮液。取1 mL 此悬浮液，0.1 mL 不同浓度样品、0.1 mL 6 mmol/L FeS04、0.1 mL 60 mmol/L H2O2，对照组加0.1 mL 的PBS。37 ℃温育1 h 后，加入1 mL 15%三氯乙酸终止反应，以3 000 r/min 离心10 min，取上清液，加入1 mL 0.67%硫代巴比妥酸后，沸水浴15 min，流水冷却，测定波长532 nm 处的吸光度。

抑制率/%=（对照孔吸光度-样本空吸光度）/对照孔吸光度×100

1.4 统计方法

利用单因素方差分析对试验数据进行统计分析，数据以平均值±标准差表示。

2 结果

2.1 藻胆蛋白粗提物、藻红蛋白、藻蓝蛋白对羟基自由基的清除能力

不同浓度的葛仙米藻胆蛋白粗提物、藻蓝蛋白和藻红蛋白对羟基自由基的清除能力见图1。

图1 不同浓度的3 种蛋白对羟基自由基的清除能力比较（n=3）Fig.1 Compare capability of scavenging hydroxyl radicals by three proteins at different concentrations（n=3）

在Fenton 体系羟基自由基清除能力试验中，结果显示藻红蛋白、藻蓝蛋白和藻胆蛋白粗提物都有较强的清除羟基自由基的能力，并且3 种蛋白都呈现出明显的浓度依赖关系。藻红蛋白在1 000 μg/mL时羟自由基清除率为（34.0±14.1）%，藻胆蛋白粗提物在1 000 μg/mL 时羟自由基清除率为（67.4±20.2）%，藻蓝蛋白在1 000 μg/mL 时羟自由基清除率为（48.3±6.1）%，羟基自由基清除能力由强到弱依次为：藻胆蛋白粗提物>藻蓝蛋白>藻红蛋白。藻胆蛋白粗提物和藻蓝蛋白羟基自由基清除能力明显强于同浓度的苯甲酸和抗坏血酸。

2.2 藻胆蛋白粗提物、藻红蛋白、藻蓝蛋白对超氧阴离子自由基的清除能力

不同浓度的葛仙米藻胆蛋白粗提物、藻蓝蛋白和藻红蛋白对超氧阴离子自由基的清除能力见图2和图3。

图2 邻苯三酚自氧化速率与浓度之间关系Fig.2 Relationship between autooxidation rate and concentration of o-benzotriphenols

图3 不同浓度的3 种蛋白对超氧阴离子清除能力比较（n=4）Fig.3 Capability of scavenging superoxide anions by three proteins at different concentrations（n=4）

通过邻苯三酚自氧化条件摸索，设置邻苯三酚浓度为34.4 mmol，此时对应的邻苯三酚自氧化反应速度为0.02ΔOD420/min（见图2），并以此条件进行后续的试验考察。超氧阴离子清除能力检测结果显示藻红蛋白、藻蓝蛋白和藻胆蛋白粗提物都有一定的清除超氧阴离子的能力，并且三种蛋白都呈现出一定的浓度依赖关系（见图3），藻红蛋白在1000μg/mL 时超氧阴离子自由基清除率为（52.1±7.1）%，藻胆蛋白粗提物在1 000 μg/mL时超氧阴离子自由基清除率为（44.2±4.3）%，藻蓝蛋白在1 000 μg/mL 时超氧阴离子自由基清除率为（50.5±11.9）%，超氧阴离子自由基清除能力由强到弱依次为：藻红蛋白≥藻蓝蛋白>藻胆蛋白。

2.3 藻胆蛋白粗提物、藻红蛋白、藻蓝蛋白抑制脂质过氧化的能力

不同浓度的葛仙米藻胆蛋白粗提物、藻蓝蛋白和藻红蛋白抑制脂质过氧化的能力见图4。

图4 不同浓度的3 种蛋白抑制脂质过氧化的能力（n=4）Fig.4 Capability of inhibit lipid peroxidation by three proteins at different concentrations（n=4）

结果显示藻红蛋白、藻蓝蛋白和藻胆蛋白粗提物都有一定的抑制脂质过氧化的能力，并且三者都呈现出一定的浓度依赖关系，藻红蛋白在1 000 μg/mL 时脂质过氧化抑制率为（47.4±4.7）%，藻胆蛋白粗提物在 1 000 μg/mL 时脂质过氧化抑制率为（28.8±4.9）%，藻蓝蛋白在1 000 μg/mL 时脂质过氧化抑制率为（16.1±10.3）%，抑制脂质过氧化能力由强到弱依次为：藻红蛋白>藻胆蛋白粗提物>藻蓝蛋白。

3 结论与讨论

自由基产生于机体内的许多氧化还原过程，它们由特定的酶（超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等）捕获或破坏。正常情况下，机体自由基的产生和清除维持一种动态平衡，一旦这个平衡被打破，过量的活性氧自由基会对机体造成伤害，如引起脂质过氧化而改变生物膜结构及功能，损伤DHA，使蛋白质变性及酶活力丧失等，这些危害直接或间接地导致了炎症、衰老、心血管疾病及肿瘤的发生[17]。超氧阴离子自由基和羟基自由基是最具代表性的活性氧自由基，在机体的氧化反应中，超氧阴离子自由基通常最先形成，通过形成其他多种有破坏作用的自由基而使其功能放大。羟基自由基毒性最强，几乎能与所有的功能性生物大分子反应，造成生物体的巨大伤害[18]。

本文采用Fenton 体系进行清除羟基自由基能力测定，采用邻苯三酚自氧化的方法进行清除超氧阴离子自由基能力的测定，并通过过氧化氢诱导脂质过氧化，测定蛋白对其的抑制作用。试验结果显示藻胆蛋白、藻红蛋白和藻蓝蛋白都有明显的抗氧化作用，但作用方式和抗氧化程度有所不同。在羟基自由基清除试验中，抗氧化活性由强到弱依次为藻胆蛋白粗提物＞藻蓝蛋白＞藻红蛋白；在超氧阴离子自由基清除试验中为藻红蛋白≧藻蓝蛋白＞藻胆蛋白粗提物；在抑制脂质过氧化试验中为藻红蛋白＞藻胆蛋白粗提物＞藻蓝蛋白。

葛仙米藻红蛋白和藻蓝蛋白虽然由葛仙米藻胆蛋白分离纯化得到，但是，在羟基自由基清除试验中藻胆蛋白粗提物的活性明显优于藻红蛋白和藻蓝蛋白，这可能是由藻胆蛋白粗提物中其他多糖或酚类物质共同作用的结果。而在超氧阴离子自由基清除试验和抑制脂质过氧化试验中，藻红蛋白的能力最强。在这3 个抗氧化能力试验中，藻红蛋白的能力均强于藻蓝蛋白，这可能是由于藻红蛋白的结构上含有比藻蓝蛋白更多的还原型残基，因此，其具有更强的抗氧化性能，而具体机理还有待进一步研究。