鸡骨素中硝基呋喃代谢物残留量的不确定度评定

王成梅 徐进

摘要：本文对鸡骨素中硝基呋喃代谢物残留量的液相色谱-质谱进行了不确定度的评定。本文参照《测量不确定度的评定与表示》相关理论，建立对应的数学模型，对鸡骨素中硝基呋喃代谢物残留量的不确定度进行来源分析和计算。本文认为不确定度的来源主要有以下几个方面：标品的纯度;配制的过程;称样量;重复测定次数;加标回收率等方面。当添加浓度在1.0μg/kg的水平下，四种硝基呋喃代谢物的不确定度分别为：硝基呋喃西林代谢物CSEM=0.981μg/kg，U=0.070μg/kg，k=2;呋喃唑酮代谢物CAOZ=1.032μg/kg，U=0.061μg/kg，k=2;呋喃它酮代谢物CAMOZ=1.068μg/kg，U=0.076μg/kg，k=2;呋喃妥因代谢物CAHD=1.007μg/kg，U=0.046μg/kg，k=2。本试验研究结果对于实际操作过程中减少不确定度，提高数据准确性和可靠性具有重要的意义。

关键词：液相色谱-串联质谱;鸡骨素;硝基呋喃代谢物;不确定度

硝基呋喃类药物是一种广谱性抗菌药物，具有价格低廉、杀菌效果强等优点。硝基呋喃类药物在体内的代谢物易与体内的蛋白质结合形成稳定的化合物。该化合物在体内贮留时间久，能诱发基因突变，具有高制畸、致癌、致突变等危害[1-3]。因此硝基呋喃它酮、硝基呋喃唑酮、硝基呋喃妥因和硝基呋喃西林列入违禁兽药，要求所有食品动物中不得检出。目前对于硝基呋喃代谢物的检测方法中高效液相色谱-串联质谱是几种检测方法中精密度最高、数据最准确的一种方法。

测量不确定度是一种表示测量值分散性的重要参数[4]，是评定结果和水平的重要指标。GB/T 27025-2008中明确规定要具有不确定度或评定不确定度的程序[5]。随着检测能力和检测数据准确性的逐渐提高，资质认定过程中不确定度已经成为检测过程中必须完成的一项工作。不确定度的研究对于检测结果的准确性判定具有重要的意义。本文通过对鸡骨素中硝基呋喃代谢物残留量的内标法进行不确定度分析，找出影响因素，从而保证数据的准确性，提高检测数据的质量。

1 材料和设备

仪器与设备

超高效液相色谱-串联质谱仪（1260-6460，美国Agilent公司）;水浴恒温振荡器;MS3 Digital涡旋振荡器（德国IKA公司）电子天平和高精密电子天平;高速冷冻离心机;纯水机;pH计;5mL、1mL和100μL移液枪;

试剂与材料

呋喃西林代谢物盐酸盐（简称：SEM.HCL，下同）纯度99.8%，德国Dr公司;呋喃妥因代谢物盐酸盐（简称：AHD.HCL，下同）纯度99.3%，德国Dr公司;呋喃唑酮代谢物AOZ纯度99.3%，德国Dr公司;呋喃它酮代谢物（简称：AMOZ，下同）纯度99.6%，德国Dr公司;呋喃西林代谢物同位素标准品SEM-13C-15N2，WITEGA公司;呋喃妥因代谢物同位素标准品AHD-13C3，WITEGA公司;呋喃唑酮代谢物氘代物AOZ-D4纯度，德国Dr公司;呋喃它酮代谢物氘代物AMOZ-D5纯度，德国Dr公司;甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷、甲酸、邻硝基苯甲醛为色谱纯，购自Fisher Scientific公司;浓盐酸、氢氧化钠、乙酸铵、磷酸氢二钾均为分析纯，购自上海国药集团;实验用水为超纯水。

实验用样品来自天博食品配料有限公司。

方法

标准溶液的配制

标准储备溶液：分别准确称取AOZ 10.06mg、SEM·HCL 14.9mg、AMOZ 10.04mg、AHD·HCL 13.26mg，AOZ-D4 10.0mg、SEM-13C-15N2 10.0mg、AMOZ-13C3 10.04mg、AHD-13C3 10.0mg，乙腈溶解配置成1.0mg/mL標准储备液。

混合标准储备液：1mL的移液枪各移取1.0mL 标准储备液于10mL容量瓶中，用乙腈定容。用同样的方法进行稀释最终得10.0Ug/L混合标准溶液。

混合内标工作溶液：按照上述方法进行同样的稀释配置成10.0μg/L内标混合工作液。

混合标准溶液的制备：分别移取10.0Ug/L的混合标准工作液50、100μL和准确吸取100.0Ug/L混合标准溶液20、50、100μL至5个50mL离心管中，分别加入20μL混合内标工作溶液，按照前处理步骤分别制成0.50、1.0、2.0、5.0、10.0μg/L的标准曲线，上机待测。

前处理

称取样品2.000g于研钵中，加入2.5-4g的硅藻土进行细细研磨。样品研磨后转移至离心管中，加入内标20μL，通过回收把控质量，再加入0.2mol/L盐酸10mL和邻硝基苯甲醛（称取邻硝基苯甲醛0.015g，甲醇定容1mL，100?L对应一个样品）。11500r/min均质1min，37℃恒温振荡器中避光衍生16h。取出冷却至室温，加入磷酸氢二钾和氢氧化钠调节pH值至7.5左右。加入5mL的乙酸乙酯，振荡20min，9000r/min离心5min。上清液转移至10mL离心管中，重复提取两次，合并提取液。40℃氮吹近干，加1mL0.1%甲酸溶液，加入2mL正己烷除油，涡旋2min，5000r/min离心5min，取下层液过0.22Um水系膜过滤，上进待测。

1.3.3 测量不确定度来源

不确定度来源主要来自以下几个方面：标品的纯度（含内标和外标）;标准溶液配制过程;混合标准溶液的配制;称样量;重复测量;复现性限R等。

2 不确定度评定

2.1 数学模型的建立

本实验按照下式（1）计算鸡骨素中硝基呋喃代谢物的残留量：

式中R表示样液中分析物与内标物峰面积的比值;c代表混合基质标准溶液中分析物的浓度（ng/mL）;V为样液最终定容体积单位为毫升（mL）;RS表示混合基质标准溶液中分析物与内标物峰面积的比值;m代表试样质量（g）。

2.2 合成不确定度公式如下式：

Urel（1）：标准品纯度引入的不确定度;

Urel（2）：内标标准品纯度引入的不确定度;

Urel（3）：标准溶液配制引入的不确定度;

Urel（4）：内标标准溶液配制引入的不确定度;

Urel（5）：称样量引入的不确定度;

Urel（6）：重复线性回收引入的不确定度;

urel（7）：加标回收率引入的不确定度

2.3不确定度的分量计算

2.3.1 标准品纯度的不确定度

SEM·HC扩展不确定度U=0.92%，由于扩展不确定度是是标准不确定度的k倍，包含因子k=2，故其纯度引入的标准不确定度为：

Urel（SEM·HCL）=U/k=0.92%/2=0.0046

AMOZ扩展不确定度U=3.73%，包含因子k=2，其引入的标准不确定度为：

Urel（AMOZ）=U/k=3.73%/2=0.01865

AOZ扩展不确定度U=1.73%，包含因子k=2，其引入的标准不确定度为：

Urel（AOZ）=U/k=1.73%/2=0.00865

AHD扩展不确定度U=2.99%，包含因子k=2，其引入的标准不确定度为：

Urel（AHD）=U/k=2.99%/2=0.01495

2.3.2 内标纯度引入的不确定度

AOZ-D4扩展不确定度U=1.95%，包含因子k=2，其引入的标准不确定度为：

Urel（AOZ-D4）=U/k=1.95%/2=0.00975

AMOZ-D5扩展不确定度U=1.15%，包含因子k=2，其引入的标准不确定度为：

Urel（AMOZ-D5）=U/k=1.15%/2=0.00575

AHD-13C3纯度为（99.8±0.2）%，其引入的标准不确定度为：

Urel（AHD-13C3）= =0.00116

SEM-13C-5N2纯度为（99.98±0.2）%，其引入的标准不确定度为：

Urel（SEM-13C-5N2）= =0.00116

2.3.3标准溶液配制引入的不确定度

2.3.3.1 标准物质称量引入的不确定度

标准物质称量不确定度来自三个方面：a，称量的重复性，可以通过10次重复称量，用UA（m1）表示;b，来自天平称量不准造成的不确定度;c，天平标度的可读性（数字分辨力）引入的不确定度。

a.对标品进行10次重复测量（注：称样量和实际称量尽可能一致），采用贝塞尔公式计算其标准偏差，标准不确定度等于1倍的标准偏差：

b.电子天平的最大允许误差为±0.03mg，区间半宽度a1（m1）=0.03mg，该分布属于均匀分布，包含因子k1（m1）= .其标准不确定度为：

c.天平分辨力引入的标准不确定度分量UB2（m1）=0.005mg，k2（m1）= 。其标准不确定度为：

合成不确定度为：

由此可得出各化合物的标准不确定度分别为：

Urel（SEM·HCL）=0.0339mg/14.9mg=0.002275

Urel（AMOZ）=0.0339mg/10.04mg=0.003376

Urel（AOZ）=0.0339mg/10.06mg=0.003370

Urel（AHD·HCL）=0.0339mg/13.26mg=0.002557

2.3.3.2 定容体积引入的不确定度

定容体积不确定来源于三个方面：第一，重复性UA（V）;第二，容量瓶允差UB1（V）;温度系数UB2（V）。

本实验通过对100mL的容量瓶定容10次，采用贝塞尔公式计算偏差，标准不确定度等于一倍的标准偏差：

标准储备液采用乙腈溶解，定容至100mL容量瓶中，配制成相应的浓度。容量瓶的检定规程《JJG196-2006 常用玻璃量具》规定100mL的容量瓶属于A级容量瓶。其所允许的偏差为±0.10。区间半宽度a1（V）=0.10。服从三角分布，包含因子k1（V）= 。其标准不确定UB1（V）为：

根据规程，容量瓶的检定是在20℃条件下进行的。而液体的体积膨胀系数远大于玻璃，因此实验过程中只需要考虑液体的体积产生的膨胀系数。乙腈的体积膨胀系数为1.37×10-3/℃，产生的体积变化为±（100×4×1.37×10-3）=±0.548mL

則区间半宽度a2（V）=0.548mL，设为区间分布，包含因子k2=，则标准不确定度为：

则合成不确定度为：

其相对标准不确定度为：

2.3.3.3 标准溶液稀释引入的不确定度

混合中间溶液采取逐级稀释的操作，从1.0mg/mL稀释到10.0μg/L。稀释过程采用10mL的容量瓶和1000μL的移液枪。10mL的容量瓶最大允许误差为±0.020mL，1000μL的移液枪的最大允许误差为±1.0%，按照均匀分布，k=，则不确定度为：

2.4 内标标准溶液配制引入的不确定度

如2.3.3 内标溶液配制过程中称样量引入的不确定度分别为：

Urel（SEM-13C-15N2）=0.0339mg/10.0mg=0.00339

Urel（AMOZ-13C3）=0.0339mg/10.04mg=0.003376

Urel（AHD-13C3）=0.0339mg/10.0mg=0.00339

Urel（AOZ-D4）=0.0339mg/10.0mg=0.00339

定容体积和稀释过程引入的不确定度如2.3.3.2和2.3.3.3一样。

2.5样品称量引入的不确定度

天平分辨力为0.1mg，区间半宽度a2=0.05mg，k3=，样品的称样量为2.00g。其标准不确定度为：

2.6 重复测量引入不确定度

对某一浓度进行重复测量10次，根据贝塞尔公式进行计算，计算公式如下;计算结果见表1

标准不确定度公式：

2.7 加标回收率引入的相对不确定度

對样品进行加标回收试验，在2μg/kg水平下进行6次加标回收实验，用如下公式进行计算。加标回收不确定度服从均匀分布，k=，计算结果见下表：

2.8 合成相对标准不确定度及不确定度

以上各项不确定度相互独立，不考虑分量之间的相关性，则合成不确定度urel（c）按照公式（2）计算和不确定度uc（X）检测结果见下表。

95%置信概率其包含因子k=2，扩展不确定度U=k*uc（X），根据计算结果为：硝基呋喃西林代谢物CSEM=0.981μg/kg，U=0.070μg/kg，k=2;呋喃唑酮代谢物CAOZ=1.032μg/kg，U=0.061μg/kg，k=2;呋喃它酮代谢物CAMOZ=1.068μg/kg，U=0.076μg/kg，k=2;呋喃妥因代谢物CAHD=1.007μg/kg，U=0.046μg/kg，k=2。

3 结论

根据测量不确定度评定方法，本实验对鸡骨素中硝基呋喃代谢物不确定度来源进行分析，通过建立数学模型，评定和计算各不确定度分量。结果表明，鸡骨素中硝基呋喃代谢物残留量测定的不确定度主要来源于标准品纯度、配制过程、样品称样量、重复测量、样品加标回收等方面。因此在日常的检测中应尽量选用纯度较高的标品，在配制的过程中选用精密度高的玻璃量器或者移液器、天平等。同时在测定的过程中尽量做到多次测量以减少检测过程中产生的不确定度，从而提高检测的准确度。

参考文献

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[4]Cordero R，Seckmeyer G，Pissulla D，et al. Uncertainty evaluation of the spectral UV irradiance evaluated by u-sing the UVSPEC radiative transfer model[J]. Opt Com-mun，2007，276（12）： 44 -53.

[5]全国认证认可标准化技术委员会. GB/T 27025—2008：检测和校准实验室能力的通用要求[S]. 北京：中国标准出版社，2008.

作者简介：王成梅（1984.12）女，汉族，山东省济宁市，中级工程师，研究生（硕士），研究方向：食品检测与安全 .

徐进（1988.7） 女 汉族 山东省济宁市，助理工程师，本科 ，研究方向：食品检测与样品管理.