HPLC-DAD法同时测定冠心康胶囊中4种活性成分的含量

黄洁文，陈燕霞，谭汉添

0 引言

冠心康胶囊是由丹参、赤芍、降香、红花和川芎等药材组成，目前的执行标准为国家食品药品监督管理局标准YBZ06522009，具有活血化瘀，行气止痛等作用，临床主要用于血瘀气滞、心脉痹阻引起的冠心病、心绞痛等症状[1-4]。丹参中的脂溶性成分隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA具有舒张冠脉和动脉、保护心肌、抗氧化的作用[5-7]，赤芍中的芍药苷也具有明显的扩张心血管、改善微循环的作用[8-10]，二者的作用与其临床药效作用一致，但是现行标准仅对赤芍中的芍药苷进行含量控制，对丹参只进行薄层鉴别，没有对其含量进行质量控制。冠心康胶囊处方中，丹参用量最大，且为方中君药，在该方的活血化瘀药效中发挥重要作用。目前，对冠心康胶囊的研究主要是针对赤芍中芍药苷或者丹参中丹参酮ⅡA的单个含量测定[11-12]，尚未有对其多成分含量的同时测定，因此，笔者参考中国药典和目前的文献报道[13-16]，建立HPLC-DAD色谱法同时测定冠心康胶囊中芍药苷、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA含量的方法，来更好地全面控制冠心康胶囊的质量，为其进一步完善质量标准提供实验参考。

1 仪器与试药

LC-2030高效液相色谱仪(日本岛津仪器公司)；LC labsolution 工作站；SPD-M10A检测器，Mettler AE240分析电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ-700VDB型双频数控超声波清洗器(江苏昆山超声仪器公司)；冠心康胶囊(西安大唐制药集团有限公司,规格：0.45 g/粒，批号：20170601、20170802、20180601)，对照品：芍药苷(批号：110736-201136，质量分数95.7%)，隐丹参酮(批号：110852-200305)，丹参酮ⅡA(批号：110766-200619，质量分数98.9%)；丹参酮Ⅰ(批号：110867-201607，含量为99.3%)，对照品均购于中国食品药品检定研究院，乙腈为色谱纯(美国Fisher公司)，水为超纯水(美国Mili-Q超纯水机)；磷酸、甲醇等均为分析纯(上海国药集团化学试剂公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent TC-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱0～12 min(15%～20%A)，12～20 min(20%～40%A)，20～30 min(40%～60%A)，30～50 min(60%～90%A)；流速：1.0 ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：230 nm(0～30 min)、270 nm(30～55 min)，进样量：10 μl。在上述色谱条件下分别测定对照品、供试品溶液及阴性样品溶液，色谱图见图1。

图1 混合对照品(A)、供试品溶液(B)、缺赤芍的阴性样品(C)、缺丹参药材的阴性样品(D)的HPLC色谱图

2.2 对照品溶液的制备 精密称取芍药苷对照品12.28 mg，置25 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为对照品储备溶液Ⅰ，精密称取丹参酮ⅡA 5.15 mg和隐丹参酮5.09 mg置同一25 ml棕色容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为对照品储备溶液Ⅱ，另精密称取丹参酮Ⅰ对照品5.94 mg，置10 ml棕色容量瓶中，加二氯甲烷1 ml使溶解，然后用甲醇稀释至刻度，作为对照品储备溶液Ⅲ，分别精密吸取上述对照品储备溶液I 5 ml、储备溶液Ⅱ 2 ml、储备溶液Ⅲ 1 ml置同一10 ml棕色容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为对照品溶液(每1 ml含芍药苷245.6 μg、隐丹参酮40.72 μg、丹参酮Ⅰ 59.4 μg、丹参酮ⅡA 41.2 μg)。

2.3 供试品溶液的制备 取冠心康胶囊10粒，混匀研细，精密称取粉末1.0 g置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，称定重量，超声处理30 min(频率：45 kHz，功率：280 W)，取出，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 阴性样品的制备 按照冠心康胶囊处方量的1/10，分别制备缺丹参药材和赤芍药材的阴性样品，按照“2.3”项下的供试品溶液制备方法制备，按照“2.1”项的色谱条件测定，测定结果见色谱图1，结果表明，阴性样品对冠心康胶囊中4种成分的测定无干扰。

2.5 标准曲线的测定 将“2.2”项下的对照品混合溶液作为5号对照品溶液，另分别精密吸取“2.2”项下的对照品溶液各1 ml，分别置10、25、50 ml和100 ml 4个容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为对照品4号、3号、2号和1号溶液，分别注入液相色谱仪，按照“2.1”项下的色谱条件进行测定，以待测成分进样量的质量(ng)为横坐标，相对应的峰面积为纵坐标进行线性回归，结果见表1。

表1 4种成分的线性方程、相关系数及线性范围

2.6 精密度 取“2.2”项下的对照品储备溶液，连续进样6次，进样量10 μl，测定各成分的峰面积，分别计算得芍药苷峰面积RSD为0.36%，隐丹参酮峰面积RSD为0.52%，丹参酮Ⅰ峰面积RSD为0.41%。丹参酮ⅡA峰面积RSD为0.66%，结果表明，该仪器的精密度良好。

2.7 稳定性和重复性试验 稳定性：取同一批供试品溶液，分别在0、1、2、4、8、12、16、24 h进行测定，进样量10 μl，连续考察24 h，记录各成分的色谱峰面积，结果显示，芍药苷、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的峰面积RSD为1.22%、1.05%、1.56%、1.37%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。重复性试验：取同一批号的冠心康胶囊样品，按照“2.3”项下的方法制备6份供试品溶液，然后分别注入液相色谱仪进行测定，进样量10 μl，结果显示，芍药苷峰含量的RSD为0.40%，隐丹参酮含量的RSD为0.36%，丹参酮Ⅰ含量的RSD为1.21%。丹参酮ⅡA含量的RSD为0.31%，表明该方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的冠心康胶囊样品0.50 g，共6份，另精密称取芍药苷42.26 mg，置10 ml量瓶中，精密吸取丹参酮Ⅰ对照品储备溶液5 ml置上述同一10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为待加溶液1。精密称取丹参酮ⅡA 18.13 mg和隐丹参酮6.03 mg置同一25 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为待加溶液2。分别精密吸取上述待加溶液1和待加溶液2各1 ml置上述6份供试品中，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行含量测定，分别计算4个成分的回收率，结果见表2。结果显示，RSD均小于3.0%，表明该方法准确度良好。

表2 4个成分的加样回收率结果(n=6)

2.9 样品的测定 取3个不同批号的冠心康胶囊样品，按照“2.3”项下供试品溶液的制备方法，每个批号分别制备3份，用“2.1”项下的色谱条件进行测定，结果求平均值，分别计算不同批次样品中4个成分的含量，测定结果见表3。

表3 4种成分含量测定结果(n=3，mg/g)

3 讨论

3.1 供试品制备的选择 本实验采用正交实验对不同的提取溶剂(甲醇、50%甲醇、70%乙醇)对供试品溶液制备方法、不同的超声时间(20、30、40 min)和不同的超声功率(120、280、320 W)进行考察，结果发现，不同溶剂对不同组分含量的影响较大，对超声功率和时间基本影响不大，故选择超声时间30 min和频率280 W。由于甲醇提取时隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的含量较大，50%甲醇提取时，丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的含量都下降50%；70%乙醇提取时，芍药苷的含量稍大，丹参酮Ⅰ含量依旧比较低。由于处方中丹参占比较大，丹参中所测成分较多，且为方中主药，综合考虑选择甲醇作为提取溶剂。

3.2 流动相和检测波长的选择 实验分别采用乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸，对流动相进行了考察。结果显示，甲醇-0.1%磷酸作为流动相时，出峰时间较长，芍药苷峰形较差，乙腈-水和乙腈-0.1%磷酸作为流动相均可以洗脱分离，基线平稳。但是乙腈-水作为流动相，芍药苷峰形有拖尾现象。当采用乙腈-0.1%磷酸作为流动相时，色谱峰形良好，对称因子较高，拖尾现象明显减少，最后确定乙腈-0.1%磷酸作为本实验的流动相系统。同时，本实验采用DAD检测器对4个共有峰进行光谱扫描，结果显示，芍药苷在230 nm下具有最大吸收，隐丹参酮在265 nm、丹参酮Ⅰ在246 nm、丹参酮ⅡA在270 nm下具有最大吸收。笔者分别比较了230、250、270 nm下的结果，结果显示，在230 nm下芍药苷含量最高，270 nm下隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA含量之和最高，并与药典中检测波长一致，因此，本实验选择变化波长进行测定，从而保证各成分的灵敏度最高。

3.3 结果的判定 现行标准中规定，芍药苷的含量为每粒不得少于2.6 mg。本实验建立的3批样品中，芍药苷的含量折算成每粒均大于2.6 mg，均符合规定。丹参药材在处方中占35.29%，2015年版《中国药典》一部项下规定丹参药材中含丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA的总量不得少于0.25%，折算后本品每粒应不得少于0.397 mg，转移率按40%计算，本品每粒含3种丹参酮类化合物的总量应不得少于0.159 mg，本实验所测3批样品含量均符合规定。

3.4 小结 本文建立了HPLC-DAD法同时测定冠心康胶囊中芍药苷、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA 4种成分含量的方法，比现行标准中仅通过芍药苷的含量进行控制更加全面，更能有效反映药品的质量，该方法经方法学验证，具有专属性强、准确度高的优点，可以用于冠心康胶囊中4种成分的含量测定。