HPLC法测定绿豆中牡荆素的含量

杨 君，王 涛，黄 建,3*，王金辉,3*

0 引言

绿豆[Vignaradiata(Linn.) Wilczek.]为豆科植物绿豆的干燥成熟种子，别名青小豆、菉豆、植豆等，为常用的药食同源中药。绿豆具有清热解毒、消暑利水之功效，常用于治疗暑热烦渴、水肿、泻利、丹毒、痈肿等症[1]。现代药理研究表明，绿豆具有抗氧化[2-3]、抑菌、抗肿瘤[4]、降血脂、降血糖[5]等活性作用。很多中成方复方中均含有绿豆，如护肝片、消络痛片和清宁丸等。绿豆中主要含有蛋白质[6-7]、淀粉[8]、微量元素[9-10]、黄酮及黄酮苷类等化学成分[11-12]。为了控制绿豆的质量，本文建立了绿豆中牡荆素的含量测定方法，并对收集到的不同产地的40批绿豆中牡荆素的含量进行分析。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters高效液相色谱仪(HPLC Waters 2690 Separations ModuLe)，检测器：Waters 2996 Photodiode Array Detector，色谱柱：Symmetry®C18(150 mm× 4.6 mm，5 μm，S/N：122BA80169)；KQ3200超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SartoriusBS210S型电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)；粉碎机(型号：FW-80，功率：460W，转速：24 000 r/min)等。

1.2 试剂和试药 液相用甲醇为色谱纯(J.T.Baker)，甲醇(分析纯)、无水乙醇、二氯甲烷为天津市富宇精细化工有限公司生产，磷酸(色谱级)为天津市光复精细化工研究所生产，水为娃哈哈纯净水。牡荆素(批号：111687-201704，纯度大于98%)购于中国食品药品检定研究院，试验所用绿豆均由葵花药业提供，经沈阳药科大学陆金才教授鉴定为豆科植物绿豆[Vignaradiata(Linn.) Wilczek.]的干燥成熟种子。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 本研究采用色谱柱Symmetry®C18(4.6 mm × 150 mm,5 μm)，以甲醇-0.3%磷酸溶液(35∶65)为流动相等度洗脱，流速：1 ml/min，检测波长：260 nm，柱温25 ℃，进样量10 μl。

2.2 溶液制备方法

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取牡荆素约10 mg，用50%甲醇配制成浓度为22.22 μg/ml的对照品工作液，4 ℃避光保存备用。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取绿豆粉末约1 g，精密移取50%甲醇25 ml于具塞锥形瓶，称重，超声30 min，冷却至室温，补重，摇匀，取上清液12 000 r/min离心5 min，取上清液，稀释2倍，用0.22 μm滤膜滤过，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 分别取空白溶剂、对照品溶液和样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，见图1，样品和对照品具有相同保留时间的色谱峰，空白溶剂在此峰位无吸收。且绿豆中牡荆素色谱峰与其他色谱峰分离度大于1.5，按牡荆素计算理论塔板数不少于3 000，说明该方法具有较好的分离效果。

图1 绿豆含量测定专属性色谱图

2.3.2 线性关系考察 取浓度为22.22 μg/ml的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，测定峰面积，进样体积分别为2、4、8、10、14、16、20 μl，以进样量为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程：Y=23 050X-11 511(r=0.999 9)，牡荆素在0.04～0.44 μg线性范围内与峰面积线性关系良好。

2.3.3 精密度试验 取浓度为22.22 μg/ml的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，重复进样6次，测定峰面积，计算峰面积RSD为0.42%，说明该仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 按“2.2.2”项下方法制备供试品样品溶液，按“2.1”项下色谱条件，在0、2、4、6、8、10、12、24 h分别进样分析，测定色谱峰面积，计算峰面积RSD为0.45%，说明绿豆中牡荆素在24 h内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验 按“2.2.2”项下方法制备供试品样品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件进样，测定色谱峰面积，计算得到绿豆中牡荆素平均含量为1.28 mg/g，RSD为1.57%，说明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率 精密称取已知含量的绿豆药材粉末6份，每份约0.5 g，分别加入适量对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，测定色谱峰面积，结果见表1，计算得到加样回收率为97.47%～101.46%，RSD为1.78%，说明该方法加样回收率良好。

表1 绿豆中牡荆素含量测定的加样回收率结果

2.4 绿豆中牡荆素的含量测定 取收集到的40批绿豆样品，按“2.2.2”项下制备供试品样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，测定色谱峰面积，计算绿豆中牡荆素的含量见表2。

表2 绿豆中牡荆素含量测定结果

3 讨论

供试品溶液制备过程中，分别对提取溶剂(二氯甲烷、50%甲醇、75%甲醇、甲醇、50%乙醇、80%乙醇、95%乙醇)、料液比(10倍量、25倍量、50倍量)、提取时间(15 min、30 min、60 min)等影响因素进行了考察，结果显示，以25倍量50%甲醇为提取溶剂、超声提取30 min制备供试品，绿豆中牡荆素的含量最高，故最终确定供试品的制备方法为：25倍量50%甲醇超声提取30 min。

本文采用HPLC法测定了绿豆中牡荆素的含量，并对收集到的不同产地的40批绿豆中牡荆素的含量进行分析，结果显示，不同产地绿豆中牡荆素含量范围为1.04～1.71 mg/g，说明不同产地绿豆中牡荆素含量存在一定的差异，但差异不明显，该方法准确、可靠、重复性好，可用于绿豆的质量控制。