草棉同源四倍体的诱导与鉴定

李昱樱，申状状，荣二花，郑赟，吴玉香

(山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

棉花属双子叶植物(Dicotyledons)、锦葵科(Malvaceae)、棉属(Gossypium)。目前有51个种，其中46个为二倍体棉种(2n=2X=26)，5个为异源四倍体棉种(2n=4X=52)[1]。草棉(G.herbaceumL.)是二倍体，属于A染色体组栽培棉。又名阿拉伯棉、小棉，也称非洲棉。长期以来在棉属四倍体棉种起源的问题上，研究者普遍认为草棉和亚洲棉是四倍体棉种A基因组的祖先供体种[2]。草棉虽然对现代纺织工业贡献不大，但与异源四倍体棉花A基因组密切相关，为异源四倍体棉花提供了纤维性状，草棉本身也具有其它棉花品种所没有的优良性状[3]，如极早熟性、抗角斑病等，因而草棉在AD组棉花进化过程中起着十分重要的作用。同时，A组亚洲棉和D组雷蒙德氏棉全基因组测序的完成[4,5]，也为AD组棉种间种质互渗及异源四倍体进化的研究提供了更大的空间。

多倍化是物种形成的重要方式，蕴藏着丰富的遗传变异的潜力，多倍体生物不仅有很强的活力，还有很多性状都优于其二倍体亲本[6]。多倍体研究对了解物种的起源和进化有十分重要意义，通常棉属被作为研究多倍体进化的模式植物，通过人工远缘杂交或加倍，可以为研究早期基因组互作和进化提供理论依据。

近年来通过陆地棉和斯特提棉的远缘杂交和染色体加倍，成功获得了染色体组完整的异源六倍体植株[7]；以草棉做母本,雷蒙德氏棉做父本进行的远缘杂交也成功获得草雷杂种[8]；也曾对亚洲棉[9]和草棉[10]进行过多倍体诱变。但草棉获得的突变型未能结铃，因此本研究在前期尝试和研究的基础上，采用改良后的初生分生组织处理法重新诱导草棉二倍体，旨在将二倍体草棉加倍成同源四倍体，获得能够结铃并且育性稳定的同源四倍体，这对于棉花的种质创新和下一步远缘杂交遗传育种具有重要意义。

1 材料和方法

1. 1 试验材料

本研究所用材料为红星草棉(GossypiumherbaceumL.)(2n=2x=26)，来源于国家种质三亚野生棉圃。

1.2 试验方法

1.2.1 多倍体诱变

本试验选用0.2%的秋水仙碱琼脂凝胶涂抹幼苗生长点48 h的方法，具体步骤如下：⑴用60 ℃温水将棉花种子浸种并不断搅拌，水温下降到40 ℃以下后静置浸泡48 h，待种子露白后，将其捞出并包裹在湿润的纱布中，待胚根伸长至2～3 cm后用镊子将种皮剥离并继续保持在湿润的环境中，待子叶展开后将幼苗移栽到装有营养液的小瓶中；⑵在幼苗露出生长点后，将0.2%的秋水仙碱琼脂糖凝胶涂抹在幼苗生长点上保持48 h，诱变结束后用清水将凝胶冲洗干净；⑶在幼苗生长点恢复生长或长出1～2片真叶后，将幼苗移栽到营养钵中，一周左右后转移至温室花盆中，待幼苗生长稳定并且室外气温适宜后可搬至室外，定期浇水管理及性状观察。

1.2.2 突变型形态学鉴定

观察诱变植株和对照植株苗期的生长状况，依据生长受阻、叶色浓绿、叶片皱缩、植株畸形等指标对得到的诱变株进行初步筛选和鉴定。在棉花生长进入花期后，选取野生型和诱变株各5株，每株棉花各选取倒三叶和倒十叶之间5片无病虫害且生长健康的叶片，测量叶长、叶宽,计算叶面积和叶形指数，并进行统计分析。

1.2.3 流式细胞仪倍性检测

具体步骤如下：(1)取新鲜待测叶片0.5 cm2，置于培养皿中。(2)用刀片将叶片切碎，加入400 μL的裂解液，来提取完整的细胞核。(3)将其用30 μm滤网过滤至样品管中。(4)将1 600 μL染液加入样品中。(5)上机测试。

1.2.4 细胞遗传学鉴定

⑴气孔保卫细胞观察：取新鲜的棉花叶片洗净，切取主叶脉附近1 cm×2 cm，浸泡在卡诺氏固定液(无水乙醇∶氯仿∶冰乙酸=5∶3∶2)中；待叶片完全脱色后，用蒸馏水将叶片清洗干净，然后切取约2 mm×2 mm的叶片置于载玻片上，下表皮朝上，加一滴1%的I2-KI溶液，染色10 min，在显微镜下观察；在10×40倍的视野下，统计气孔数量；在显微镜10×100倍的视野下，测量气孔保卫细胞的长度，并进行统计分析。

(2)有丝分裂观察：采取根尖有丝分裂制片法，将收获的饱满的种子，60 ℃温水浸种24～48 h，将其捞出包裹在湿润的纱布中，每日清水洗涤两次；待种子根长长至1 cm，剪取根尖放入适量的饱和对二氯苯溶液中，室温下预处理3～4 h；用蒸馏水清洗3遍，转入卡诺氏固定液中固定，室温过夜；用蒸馏水清洗3次，放于1 mol·L-1HCl中解离3 h，用蒸馏水清洗3次，转入蒸馏水中漂洗过夜；然后将其置于装有卡宝品红的小瓶子中，染色过夜；用刀片切取1～1.5 mm于干净载玻片上，盖上盖破片，压片；置于显微镜下观察，选取并统计50个以上的染色体分散良好细胞照相并计数。

2 结果与分析

2.1 草棉突变型和野生型形态特征比较

对所获得的突变型进行初步形态学判断，选取形态性状符合多倍体的突变型5株进行相关指标测定。突变型生长受阻，叶片颜色浓绿，且叶片皱缩、增厚；茎干较野生型粗。对5株突变型和野生型的相关指标进行统计分析，结果显示突变型叶片变大，野生型和突变型的叶长、叶宽存在极显著差异；二者的叶长X叶宽值、叶形指数存在显著差异(表1)。突变型叶长与野生型叶长相比变化幅度为+25.25%，突变型叶宽与野生型叶宽相比变化幅度为+30.31%，突变型叶长X叶宽值与野生型叶长X叶宽值相比变化幅度为+36.55%，突变型叶形指数与野生型叶形指数相比变化幅度为-3.89%，结果表明突变型的诱变效果明显，初步形态学特征表明突变型为多倍体。

表1突变型和野生型的形态学指数差异

Table1 Morphological indices variation of mutants and wild type

材料Material叶长/cmLeaf length叶宽/cmLeaf width叶长×叶宽/cm2Leaf length×Leaf width叶形指数Leaf index突变型4.79±0.966.28±1.2131.03±11.30.76±0.07野生型3.82±0.754.82±0.8522.73±7.490.8±0.08变化幅度+25.25%+30.31%+36.55%-3.89%P value0.0015 0.0001 0.0137 0.1753

2.2 流式细胞仪倍性检测

根据对突变型的初步形态学鉴定结果，采用流式细胞仪对5株突变型进行倍性检测(图1)，结果显示野生型的峰值在200，而突变型5的峰值在400，突变型1、3、4的峰值在380，突变型2的峰值在420，表明5株突变型的DNA含量接近野生型DNA含量的二倍。流式细胞倍性检测结果表明，所测植株中有1株为四倍体植株，其余4株为非整倍体植株。

图1 突变型和野生型流式细胞倍性检测结果Fig.1 Flow cytometry results for ploidy level between mutants and wild type

2.3 叶片下表皮气孔性状的鉴定结果

对突变型和野生型的叶片下表皮气孔密度、保卫细胞长度进行观察并测量，统计分析50个清晰的视野，结果表明突变型和野生型的气孔密度、保卫细胞长度存在显著差异，且随着倍性提高，突变型气孔密度比野生型降低25.29%，突变型保卫细胞比野生型长度增加32.86%，结果进一步证明突变型为四倍体植株(表2)。

表2突变型和野生型的气孔性状的差异

Table2 Difference of Stomatal characters between mutants and wild type

材料Material气孔密度Stomatal density保卫细胞长/μmGuard cell length突变型33.27±5.33.34±0.41野生型44.47±5.182.52±0.26变化幅度-25.29%+32.86%

2.4 突变型细胞学鉴定(染色体)

判断植物染色体倍性最具说服力的标准是染色体数目的变化。根据对突变型的流式细胞倍性鉴定结果，将四倍体突变型5的种子单独收获，并对所收获的种子进行根尖有丝分裂染色体鉴定，选取50个以上的染色体分散良好的细胞进行染色体计数(图2)，结果表明所有二倍体草棉根尖染色体数目均为2n=2x=26，而其突变型经鉴定染色体数目均为2n=4x=52(图 2)，本研究细胞学结果表明突变型的染色体数为对照的2倍,即为同源四倍体。

图2 突变型和野生型有丝分裂中期染色体数比较Fig.2 Chromosomes at Metaphase of mitosis between mutants and wild type(left is mutant and right is wild type)

3 讨论与结论

3.1 多倍体鉴定方法探讨

关于如何鉴定多倍体，长期以来一直是远多倍体育种工作者十分关注的热点问题，目前已知鉴定的方法有若干种，但效果和优缺点各不同。采用形态学鉴定不够准确，需要用其它方法进一步验证。流式细胞结果易分析，但所需要的费用比较昂贵。染色体计数是最直观的鉴定倍性的方法，也可以区分非整倍体或染色体的缺失或增多等，但花费时间比较长。袁素霞等通过根尖有丝分裂方法鉴定了甘蓝类蔬菜的倍性[11]；郭计华等通过流式细胞技术鉴定了香蕉的倍性[12]。本试验使用形态学、根尖有丝分裂染色体数、叶片下表皮气孔密度和长度,以及流式细胞技术等方法综合对突变型进行鉴定，结果表明突变型有1株为同源四倍体，4株为非整倍体植株，突变型的其它性状及其育性还在进一步观察和研究中。

3.2 人工诱导多倍体方法的选择

长期以来，有各种各样诱导多倍体的方法，但目前主要采用物理方法、化学方法和生物学方法[13]。物理法是用温度、离心力等各种物理方法对染色体进行加倍，但由于效率低且不稳定而未普遍使用。化学方法因其成本低，操作简单而被广泛使用。目前最常用的方法是使用秋水仙碱等化学诱变剂进行诱变。秋水仙碱是从百合科秋水仙植物中提取出来的，是一种剧毒的有机化合物[14]。1937年，随着秋水仙碱的加倍效果被发现，作用于组织分裂最旺盛的部分，成为使用最广泛的的诱变剂之一[15,16]。生物学方法尽管取得了一些成效，但存在一些缺点，如费用昂贵，成活率低，要想获得理想材料，仍然需要进一步研究。

很久以来育种工作者就已经认识到了多倍体的重要性。植物染色体加倍的同时，会使多倍体植株生长缓慢，导致生育期推迟，这对于观赏性的花卉具有重要意义，也会增强植株的抗逆性。而且植物多倍体能丰富遗传基础，在棉花育种中发挥重要作用。此外，通过多倍体进行早期基因组进化机制研究也得到了广泛关注[17]。

本研究采用秋水仙碱诱导初生分生组织的方法对草棉进行多倍体诱导，结果表明5株诱变株和野生型形态性状差异显著，进一步分析鉴定表明，有1株为同源四倍体，并且能够获得饱满种子，且育性稳定，其余4株为非整倍体植株，后续观察和研究还在进行中。