基于振动光谱技术对阿德福韦药物共晶的结构表征

金顺吉,杜 勇

(中国计量大学 机电工程学院,浙江 杭州 310018)

药物的低生物利用率一直是一个棘手的问题,只有接近1%的药物活性成分能成为临床广泛应用的药物[1]。导致药物低生物利用率的主要原因是药物活性成分极其不理想的理化性质,如低熔点、低溶解度以及人体对药物的低吸收性等[2]。阿德福韦(Adefovir,AD)是一种重要的抗病毒药物,它有较强的抗艾滋病毒、乙肝病毒及疱疹病毒的作用[3],但其低溶解度的缺陷极大限制了它的药物生物利用率。在不改变它原有药物活性成分的前提下得到高溶解度的稳定AD,成为国内外众多研究机构的课题。传统研究中,研究人员通过得到药物活性成分的多晶型物、溶剂化物或盐来改善药物的理化性质。近年来,随着共结晶技术的发展,人们发现通过共结晶可以有效改善药物的理化性质和临床性能,且药物的化学结构、固有的生物活性以及药理活性在大部分情况下几乎不受影响,因此在制药工业领域药物共晶体的研究越来越得到重视[4-8]。目前AD主要以其前药阿德福韦酯(Adefovir dipivoxil,ADD)的形式在临床上应用,人们对AD的研究以ADD为载体,通过形成ADD药物共晶的方法来改善AD的溶解度和稳定性等问题,成功制得几种ADD药物共晶[9-15]。本文试图直接通过共结晶的方法制备得到一种AD的稳定药物共晶,从而改善AD和ADD存在的低溶解度等不佳药物理化性质问题。通过对AD分子结构的研究,选择合适的共晶合成物2,6-吡啶二羧酸(Dipicolinic acid,DPA),得到了新型的抗病毒药物共晶阿德福韦-2,6-吡啶二羧酸(AD-DPA),且Zhang等对其结构和溶解度展开了研究,得到AD-DPA共晶的水溶性优于AD的结论[16]。有研究报道表明,药物晶体某些特定的物理化学性质,如熔点、溶解度和稳定性在一定程度上取决于药物活性成分内部独特的分子结构,于是得到共晶的分子结构排布对晶体工业制药领域具有重要意义[17]。于是,如何高质量、精确地表征分子结构细微的变化成为了一个新的研究热点。在传统研究中,研究人员大多采用X射线衍射技术来检测药物晶体结构,同时也会选用差示量热扫描、色谱法等方法来做辅助表征晶体分子结构。而振动光谱技术因其具有高灵敏度和高选择性,并能产生与晶体结构相关的指纹信息,适用于表征药物分子内和分子间相互作用。特别是太赫兹(Terahertz,THz)光谱能够敏感地探测到分子低频振动区域内的偶极跃迁,可以有效地分析和识别由于分子间相互作用引起的分子结构变化,是一种涉及分子结构的通用指纹光谱,且它与红外光谱中偶极矩变化的选择规则相同,因此结合THz光谱和拉曼光谱能够完整描述不同药物共晶的低频振动运动,近年来越来越被广大研究人员采用为首选物质检测技术[18-21]。因此,本文采用拉曼光谱技术和太赫兹光谱技术两种振动光谱技术,得到了AD与DPA在形成共晶结构前后的特征指纹谱,并对指纹谱做特征峰峰位归属,结合密度泛函理论对AD-DPA共晶分子结构进行了探究。

1 药物共晶实验设计与理论模拟

1.1 药物共晶合成机制

在设计共晶时,一般要考虑两个基本原则。第一,选用的药物活性成分与备选共晶合成物能否在实验条件下得到目标共晶产物;第二,目标共晶产物的理化性质以及生物利用率是否优于原料药。Perlovich曾对727个可变化学计量的药物共晶体熔点和溶解度进行了调查,结果发现211个共晶体(29%)能够明显改善药物活性成分的理化性质,且占多数的共计400个共晶体(55%)的理化性质优于药物活性成分[22]。从他的研究可以初步得到结论,大部分情况下得到的共晶体相比原料药都具有更优的理化性质,所以开发人员更关注共晶的制备过程中所需实验条件。通常,非共价键的作用(氢键、Π-Π键、范德华力等)是诱导形成共晶的主要原因,其中氢键的作用最为显著[23]。在给定药物活性成分的前提下,选用那些在满足GARS(Generally considered as safe)要求下具有合适的氢键结合官能团的化合物,成为能否制备成功的关键所在。综合之前报道的共晶氢键结合方式,其中N—H…O,N—H…N,O—H…O,O—H…N是最常见的氢键结合方式[24]。

1.2 实验方法

在设计AD共晶体前,应先对AD的分子结构做初步分析。AD是一种白色粉末,pH=2.0时溶解度高(19 mg/mL),pH=7.4时溶解度低(0.4 mg/mL),具有多个氢键的受体与供体。在共晶合成物的选用方面,采用了DPA这种常见的医药中间体,其含有吡啶N、羧基官能团,具备与AD形成分子间氢键的理论条件。本文选用溶液结晶法,即利用溶剂作用溶解两种原料药,通过缓慢蒸发和冷却结晶的方法分离结晶产物和溶液的方法。此方法的关键是对两种物质比例的控制,只有准确把握两种物质的比例才能生成共晶体,本文得到是AD∶DPA=1∶1的共晶体[25]。将AD与DPA以1∶1的化学计量比溶于等体积混合的水和乙醇溶液中,将反应体系升温至90 ℃充分搅拌得到无色透明溶液,将溶液转移至蒸发皿在室温下冷却而后放置于20 ℃的真空干燥箱中,5 d后得到白色针状晶体。同时设置一个物理混合的对照组,称量两种物质以化学计量比1∶1通过涡流搅拌器物理混合。将两种原料药和物理混合物以及得到的晶体碾碎至几个微米级别的颗粒,从而减小THz光谱检测过程中颗粒样品的散射效应,并且所有样品颗粒都通过压片机制成厚度为1.5 mm和直径为13 mm的片状药片而满足THz光谱检测要求。THz检测过程为了减少对周围水蒸气的辐射吸收,需在环境温度为25 ℃,且充满高纯度氮气的密闭空腔中进行,通过计算代表完整样品和参考测量值的四个THz频谱的平均值来获得每个最终频谱。同时THz电场的时域信号记录每个样品和参考样品(没有样品架)的数据,然后在快速傅里叶变换(FFT)操作之后,将样品频率响应除以THz来获得样品的THz吸收光谱。对于拉曼光谱的检测,因为其具有快速且无需考虑样品特定外形的优点,所以制样简单,样品颗粒无需进一步处理即可直接用于拉曼检测。在检测过程中,一般只需增加扫描次数来提高光谱的分辨率即可。

1.3 量子化学理论模拟

量子化学是进行化学问题研究的一种重要技术手段,它基于量子力学理论来计算和分析分子结构、分子间碰撞、相互反应等问题。密度泛函理论(Density functional theory,DFT)是应用于多电子体系的一种重要计算方法,它指出待计算分子性质取决于体系的电子密度,当所有的电子密度信息都已知时,则通过DFT计算就能获得体系所有的结构和性质信息,具有计算能力强,精度高的优点[26]。本文通过Gaussian 09量子化学软件内置的DFT计算,分析计算AD-DPA共晶的分子结构,通过查阅文献得到相关的X射线衍射技术(X-Ray Diffraction,XRD)结果,根据各原子间键长和键角信息,将合理的理论分子结构通过GaussView画出后输入到Gaussian 09中,选择B3LYP此种常用的DFT的计算方法并选用6-311G(g,p)基组进行量子化学计算。将DFT计算得到的THz和拉曼理论光谱图与实验结果对比,从而筛选出最合理的分子结构进一步分析各特征峰的振动模式。

2 振动光谱检测与分析

2.1 共晶体的结构设计

AD和DPA分子结构如图1所示,根据共结晶过程中典型氢键的结合方式推断可得,通过酰胺-羧酸和磷酸-羧基异构合成子能够形成共晶。

图1 阿德福韦和2,6-吡啶二羧酸的分子结构图Figure 1 Molecular structures of AD and DPA

根据AD和DPA的分子结构,Zhang等推断出它们的共晶结构如图2(a)所示,这里将其命名为共晶形式Ⅰ,由图可知共晶形式Ⅰ是磷酸-羧酸分子间氢键的作用下形成1:1二元化合物[15]。除此之外,本文假设另二种可能存在的共晶结构,命名为共晶形式Ⅱ和共晶形式Ⅲ,Ⅱ与形式Ⅰ的结构类似,区别就在于磷酸上的羟基而非羰基参与氢键的形成,如图2(b)所示。图2(c)给出的理论形式Ⅲ则是由羧酸-吡啶和羧酸-酰胺两种分子间氢键形成1∶1二元化合物。传统检测技术无法实现细微分子结构变化的检测,而THz光谱和拉曼光谱能够检测到分子间和分子内相互作用,这也是本文采用振动光谱技术作为检测手段的主要原因。

图2 阿德福韦-2,6吡啶二羧酸共晶分子形式Ⅰ(a),分子形式Ⅱ(b)和分子形式Ⅲ(c)Figure 2 Molecular structures of AD-DPA co-crystal form Ⅰ(a), form Ⅱ(b)and form Ⅲ(c)

2.2 共晶光谱分析

2.2.1 共晶的太赫兹光谱分析

AD、DPA、物理混合物及其共晶在0.20～1.60 THz的太赫兹吸收光谱如图3所示。可以清楚地看出,AD存在两个宽峰带,分别在1.07和1.47 THz处,而DPA并没有明显的吸收峰。物理混合物有两个在1.05和1.44 THz由AD贡献的吸收峰,这表明物理混合物的吸收峰是两种原材料的线性相加,并没有出现新特征峰带,从而推断出简单的物理混合过程中不会涉及氢键或其他非共价键的作用。与此同时,共晶的THz光谱中出现了原料药和物理混合中未被观察到的新特征峰带,分别在0.28、0.37、0.94、1.07、1.33 THz。这一现象表明,起始母体材料在蒸发结晶的过程中通过分子间氢键、Π-Π键等非共价键的作用,成功地形成了相应的共晶结构。

图3 阿德福韦(a),2,6-吡啶二羧酸(b),物理混合(c)和共晶(d)的THz谱对比Figure 3 THz spectra of AD (a), DPA (b), physical mixture (c) and co-crystal (d)

表1 共晶的THz光谱振动模式归属Table 1 THz spectra vibrational modes assignment of co-crystal

图5 共晶位于不同特征峰处的振动模式图Figure 5 Vibrational modes description of co-crystal at different characteristic peaks

2.2.2 共晶的拉曼光谱分析

拉曼光谱在过去二十年经历了极大的发展,其具有快速、无损、无需样品制备等优点[28]。它相比太赫兹吸收光谱对比,是基于光散射现象来探测分子的振动跃迁,这可以看作是入射光子与处于初始能态的分子的非弹性碰撞。拉曼光谱中观察到的带是特定分子的结构信息,如分子的振动跃迁和电子极化率,以及分子的振动能跃迁[29]。拉曼散射光谱可以很好地表征形成共晶形式之后分子结构的变化。图6给出了实验获得的AD、DPA、物理混合以及对应共晶的拉曼光谱。从图6中可以看出,与THz光谱的检测结果类似的结论:物理混合物的特征峰的出现也分别基于AD和DPA的光谱线性叠加,混合物在简单的物理混合过程中不涉及非共价相互作用。同时,AD的Raman光谱与Kopecky关于不同pH条件下AD多晶型转化的工作报道一致,因此可以确定本工作中使用的AD样品属于多晶型Ⅰ[30]。与物理混合物的拉曼光谱相比,共晶表现出不同的拉曼光谱信息。对于共晶的实验拉曼光谱,在1 374和1 720 cm-1处存在物理混合物不具有独特的特征峰(用灰色虚线标出,以便在图6中观察)。类似地,在物理混合物中,在1 334和1 353 cm-1处,主要由AD贡献的特征峰却在共晶中并不能观察到(图中用灰色矩形阴影显示,以便在图6中观察),这些变化是基于共晶结构中分子间氢键等分子间作用力而生成的。除了上述差异之外,共晶的拉曼光谱因为分子共轭程度的改变在728 cm-1处相比物理混合物740 cm-1出现了红移现象,而在773 cm-1处特征峰发生了蓝移。结合之前讨论的太赫兹光谱数据,可以确定通过溶液结晶的方法成功制备得到了AD-DPA共晶。

图6 阿德福韦(a),2,6-吡啶二羧酸(b),物理混合(c)Figure 6 Raman spectra of adefovir (a), 2, 6-dipicolinic acid (b), physical mixture (c) and co-crystal (d)

表2 AD-DPA共晶的拉曼光谱振动模式归属Table 2 Raman spectra vibrational modes assignment of AD-DPA co-crystal

图7 理论共晶形式Ⅰ(a)和实验共晶(b)Figure 7 Comparison of Raman spectrum between theoretical cocrystal form Ⅰ(a) and experimental co-crystal (b)

3 结 论

本文利用THz和拉曼光谱作为检测手段,成功的获得了AD和DPA及相应共晶的光谱结果。一方面证实了通过溶液挥发的手段能够成功获得共晶,共晶结构中的官能团和分子振动模式的不同是导致共晶的振动光谱区别于原料的主要原因,这为今后这种类型共晶的检测提供了基础数据和新的研究方法;另一方面,得到的振动光谱结果包含丰富传统的检测手段无法获得的分子振动信息,能全面诠释药物共晶体分子间/分子内的结构变化情况和振动信息。同时将实验结果与理论计算结果做对比,通过对比DFT理论计算振动光谱与实验获得的振动光谱,证实了共晶的分子结构与Zhang等小组所报道结果相同。同时,对得到的光谱的特征峰进行峰位归属,每个特征峰的振动模式分配是分子结构信息的具体反映,体现振动光谱的指纹性。通过THz和拉曼振动光谱技术得到的指纹谱信息结合振动模式归属,为未来该类药物的快速筛选和在线检测提供了关键数据和理论支持。