纤维素酶法辅助提取火棘果多糖的工艺研究

李彬，张薇

（商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西商洛 726000）

火棘果（Pyracantha fortuneana（maxim）Li），又称救军粮，水杈子。蔷薇科，常绿灌木，是一种可药可食可观赏的多用途花果植物，以果实、根、叶入药，性平，味甘、酸，叶能清热解毒，外敷治疮疡肿毒，是一种极好的春季看花、冬季观果植物。研究表明火棘果中含有的功能性成分主要有黄酮、多酚、多糖、色素等，具有预防肿瘤、保护心肌、降血脂、改善脂蛋白、消食健脾等作用[1-3]。目前对火棘果的研究主要集中在红色素、黄酮、果胶的提取、分离纯化和保健作用等方面，对火棘果多糖提取的研究较少。多糖作为重要的生物活性物质，具有调节免疫、抗肿瘤、降低糖脂、延缓衰老等活性，在食品、医疗保健等领域有着广阔的应用前景[4]。鉴于此，本研究采用纤维素酶辅助提取火棘果中多糖类物质，在单因素试验的基础上，经正交试验通过对料液比、酶浓度、酶解温度、乙醇体积分数等条件对多糖类物质提取工艺进行了优化，以确定火棘果中多糖提取的最优工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 供试材料

火棘果（2018 年12 月采自商洛市商州区）。

1.1.2 试剂

葡萄糖标准品；纤维素酶（酶活力＞30 u·mg-1）；石油醚、盐酸（20%）、活性炭、氯仿、正丁醇、苯酚（重精馏）、浓硫酸、无水乙醇、95%乙醇、无水乙醚等（以上药品均为分析纯或生化试剂）。

1.1.3 仪器

干燥箱、高速粉碎机、离心机、紫外分光光度计等。

1.2 方法

1.2.1 预处理

将采集的火棘果清洗干净后晾干，于60 ℃干燥48 h 至恒重，经高速粉碎机粉碎后过60 目筛，棕色瓶中密封冷藏备用。

1.2.2 粗多糖的提取

将适量火棘果粉末加入适量石油醚（70 ℃～90 ℃）回流脱脂2 次，回收石油醚。准确称取回流后的火棘果粉末2.0 g，加入一定体积的蒸馏水，按一定的提取条件（料液比、酶浓度、酶解温度、酶解时间、乙醇体积分数、缓冲液pH 等）进行浸提，待反应结束后立即在沸水浴中灭活10 min，经 4 000 r·min-1，离心 20 min 后弃去沉淀，待提取液冷却后用Sevag 法去除蛋白，活性炭吸附法去除色素，加入5 倍体积95%乙醇沉淀，于4 ℃静置过夜。将醇沉液于4 000 r·min-1，离心10 min，取沉淀物，依次用无水乙醇、无水乙醚洗涤2～3次，干燥后即得火棘果粗多糖[7]。

1.2.3 火棘果多糖含量的测定

1）标准曲线的绘制

以0.25 mg·mL-1葡萄糖溶液为标准工作液，使用苯酚-硫酸法[8]测定多糖含量。以蒸馏水为空白参比，在490 nm 处测定其吸光度（重复3 次，取其平均值），根据实验结果绘制标准曲线，并计算回归方程。

2）火棘果粗多糖含量的测定

准确称取样品粗多糖，加水溶解后定容于10 mL 容量瓶中，摇匀，吸取1 mL 溶液于具塞试管中，采用苯酚-硫酸法测定其吸光度，根据标准曲线的回归方程，计算多糖提取率的公式为[9]：

式中：C——样品提取多糖浓度，mg·mL-1；

V——提取液的体积，mL；

N——样品溶液稀释倍数；

m——火棘果样品重量，g。

1.2.4 主要工艺参数的单因素试验

1）料液比对火棘果多糖提取率的影响

准确称取回流后的火棘果粉末2.0 g，按照1.2.2 的方法，调整溶液pH 为4.0，在乙醇体积分数为80%，纤维素酶浓度为0.6%，于50 ℃恒温水浴中浸提120 min。分别考察料液比为1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35 时其对火棘果多糖提取率的影响，测定样品的吸光度并计算多糖的提取率[10-11]。

2）酶浓度对火棘果多糖提取率的影响

准确称取回流后的火棘果粉末2.0 g，按照1.2.2 的方法，调整溶液pH 为4.0，在料液比1:15，乙醇体积分数为80%，于50 ℃恒温水浴中浸提120 min。分别考察酶浓度为0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%时其对火棘果多糖提取率的影响，测定样品的吸光度并计算多糖的提取率[10-11]。

3）酶解温度对火棘果多糖提取率的影响

准确称取回流后的火棘果粉末2.0 g，按照1.2.2的方法，调整溶液pH 为4.0，在料液比为1:15，乙醇体积分数为80%，纤维素酶浓度为0.6%，于不同温度恒温水浴中浸提120 min。分别考察酶解温度为 35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃时其对火棘果多糖提取率的影响，测定样品的吸光度并计算多糖的提取率[10-11]。

4）酶解时间对火棘果多糖提取率的影响

准确称取回流后的火棘果粉末2.0 g，按照1.2.2的方法，调整溶液pH 为4.0，在料液比为1:15，乙醇体积分数为80%，纤维素酶浓度为0.6%，于50 ℃恒温水浴中浸提不同时间。分别考察酶解时间为30、60、90、120、150、180 min 时其对火棘果多糖提取率的影响，测定样品的吸光度并计算多糖的提取率[10-11]。

5）乙醇体积分数对火棘果多糖提取率的影响

准确称取回流后的火棘果粉末2.0 g，按照1.2.2 的方法，调整溶液pH 为4.0，在料液比为1:15，纤维素酶浓度为0.6%，于50 ℃恒温水浴中浸提120 min。分别考察乙醇体积分数为65%、70%、75%、80%、85%、90%时其对火棘果多糖提取率的影响，测定样品的吸光度并计算多糖的提取率[10-11]。

6）缓冲液pH 对火棘果多糖提取率的影响

准确称取回流后的火棘果粉末2.0 g，按照1.2.2 的方法，在料液比为1:15，乙醇体积分数为80%，纤维素酶浓度为0.6%，于50 ℃恒温水浴中浸提120 min。在 pH3.0～5.0 纤维素酶具有较强的活力，分别考察缓冲液pH 为3.2、3.6、4.0、4.4、4.8、5.2 时其对火棘果多糖提取率的影响，测定样品的吸光度并计算多糖的提取率[10-11]。

1.2.5 正交试验

在主要工艺参数对火棘果多糖提取率的影响基础上，以多糖提取率为指标，选取具有显著影响的工艺参数进行正交优化，以确定火棘果多糖提取的最优工艺条件。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

标准曲线绘制结果见图1，葡萄糖标准曲线回归方程是y=9.3643x-0.012，R2=0.9979。

图1 葡萄糖的标准曲线

2.2 主要工艺参数对多糖提取率的影响

2.2.1 料液比对火棘果多糖提取率的影响

由图2 分析可知，随着料液比的增加，多糖提取率呈先增高后降低的趋势，料液比为1:15时达到最大值。这可能是由于料液比在较低时，多糖不能很好的洗脱；当料液比增大时，由于酶对细胞壁的充分反应使物料渗透性加大，促进多糖溶出，利于多糖的充分提取；继续增大料液比，会稀释料液中酶的浓度，过多溶剂会使物料分子相互作用减弱，降低溶出速度，也不利于醇沉工艺操作[12]。综合考虑提取率和能耗，选择料液比1:10～1:20 为较佳。

2.2.2 酶浓度对火棘果多糖提取率的影响

由图3 分析可知，随着酶浓度的增大，多糖提取率呈先增高后稍微降低的趋势，其原因是酶浓度低时，火棘果细胞壁酶解不完全，多糖物质溶出较少；当酶浓度最佳时，酶解反应较彻底，此时多糖溶出最多；酶浓度过高时，酶与底物的接触面积过剩，使反应速率降低，多糖溶出会降低，且增加了成本[13]。考虑提取率及节约酶用量，酶浓度0.5%～0.7%为火棘果多糖提取的较佳浓度。

图2 料液比对火棘果多糖提取率的影响

图3 酶浓度对火棘果多糖提取率的影响

2.2.3 酶解温度对火棘果多糖提取率的影响

由图4 分析可知，随着酶解温度的不断增加，多糖取率呈先增高后降低的趋势，在50 ℃时，提取率达到最高，随后提取率降低。其原因是温度高于酶催化所需要的最适温度，过高的温度导致酶活力降低或使部分酶失活[14]，造成提取率降低。温度在45 ℃～55 ℃为火棘果多糖提取的较佳温度。

图4 酶解温度对火棘果多糖提取率的影响

2.2.4 酶解时间对火棘果多糖提取率的影响

由图5 分析可知，随着酶解时间的不断增加，多糖提取率呈先增高后降低的趋势，酶解时间为120 min 时，提取率达到最高。这可能是随酶解时间的增加，细胞壁结构被完全破坏，提取反应越完全，多糖提取率不断增高。但随着提取时间太长，则造成多糖的结构会发生变化或降解[15]，从而降低了多糖的提取率。确定浸提时间在120 min火棘果多糖提取率最佳。

图5 酶解时间对火棘果多糖提取率的影响

2.2.5 乙醇体积对火棘果多糖提取率的影响

由图6 分析可知，随着乙醇体积分数的增加，多糖提取率呈先增高后降低的趋势。多糖的沉淀主要是因为加入乙醇，可降低水溶液的介电常数，使多糖脱水而沉淀。在乙醇体积分数65%～80%的范围之间，随着乙醇体积分数增加，沉淀现象越明显，沉淀所用时间也相应缩短。当乙醇体积分数大于80%后，提取率反而逐渐降低，这是因为乙醇量增加的同时，也使体系总溶液量增加，从而稀释了体系中目标物浓度，不利于多糖沉淀[15]，故乙醇体积分数在75%～85%火棘果多糖提取率较佳。

图6 乙醇体积分数对多糖提取率的影响

2.2.6 缓冲液pH 对火棘果多糖提取率的影响

由图7 分析可知，随着缓冲液pH 的增大，火棘果多糖提取率呈先增高后降低的趋势，缓冲液pH 为4 时，多糖的提取率达到最大值。酶与最适pH 值偏离较小时，酶变性程度低，但酶活性部位的基团离子会发生改变，使酶活力降低；酶与最适pH 值偏离较大时，维护酶三维结构的共价键受到干扰，使酶蛋白自身变性[10]。缓冲液pH 超出纤维素酶的最适pH 范围，使纤维素酶活性丧失，导致火棘果多糖提取率降低。故确定缓冲液pH 为4 时火棘果多糖提取率最佳。

图7 缓冲液pH 对火棘果多糖提取率的影响

2.3 正交试验

根据主要工艺参数对多糖提取率的影响结果，选择对多糖提取率影响较显著的因素（ρ≥1.5%）如料液比、酶浓度、酶解温度、乙醇体积分数等4 个因素，进行L9(34)正交试验优化，并确定酶解时间为120 min，缓冲液pH 为4。正交试验因素水平设计见表1，正交试验结果及直观分析见表2，正交试验结果的极差分析见表3。

2.3.1 正交试验因素水平设计

2.3.2 正交试验结果

由表1、表2 和表3 可知，影响火棘果多糖提取率的因素依次为A＞B＞D＞C，即料液比＞酶浓度＞乙醇体积分数＞酶解温度。正交试验分析确定最佳工艺条件为A2B2C2D2。

表1 正交试验因素水平表

2.3.3 验证性试验

因为正交试验分析的优组合A2B2C2D2与正交试验中最佳组合A2B2C3D1不一致，故进行验证实验，结果见表4。

表2 L9(34)正交试验结果及直观分析

表3 L9(34)正交试验结果的极差分析

表4 火棘果多糖提取验证试验结果

由表4 可知，在A2B2C2D2条件下多糖提取率高于A2B2C3D1条件下，因此正交试验得出的最优组合A2B2C2D2符合实际。即纤维素酶法辅助提取火棘果多糖的最佳工艺参数为：料液比1:15、纤维素酶浓度0.6%、酶解温度50 ℃、酶解时间120 min、乙醇体积分数为80%、缓冲液pH 为4.0，火棘果多糖的提取率为5.35%。

3 讨论与结论

本研究发现主要工艺参数对多糖提取率的影响试验表明，在料液比为1:15～1:20，酶浓度为0.5%～0.7%，酶解温度为 45 ℃～55 ℃，酶解时间为 90～150 min，缓冲液为 pH 3.6～4.4，火棘果多糖的提取率均达到较大值。料液比、酶浓度、酶解温度、乙醇体积分数对多糖的提取率有明显影响，而酶解时间和缓冲液pH 的影响相对较小。本研究正交试验表明，纤维素酶法辅助提取火棘果多糖的最佳提取工艺条件为A2B2C2D2。即料液比1:15、纤维素酶浓度0.6%、酶解温度50 ℃、酶解时间120 min、乙醇体积分数80%、缓冲液pH 为4.0，火棘果多糖的提取率为5.35%。由于实验设计时需要考虑的影响因素较多，未涉及到原料的粒度和提取级数对火棘果多糖提取率的影响，应在后续研究中予以关注。酶法辅助提取火棘果多糖较一般传统提取技术有节省能源、省工、省时、对环境污染低等优点，但大规模用于工业生产还需要进一步解决提取条件的精确控制等方面问题[16]。另外，采取多种酶联合使用，或者联合微波处理或超声处理对火棘果多糖的提取能否更有效地提高提取率，有待进一步深入研究。