野生艾蒿内生菌的分离及其拮抗活性菌的筛选

冀玉良，肖一桐，王明迪

（商洛学院生物医药与食品工程学院，陕西商洛 726000）

植物内生菌是在植物生活史的一定阶段或全部阶段存在于其各种组织、器官的细胞间隙或细胞内的微生物。植物内生菌是一个十分丰富的类群，许多植物内生细菌、真菌及放线菌对植物病原菌都有拮抗作用，它们的防病机理主要表现在通过产生抗生素类、水解酶类、分泌植物生长调节剂和生物碱类物，与病原菌竞争营养物质或生存空间，增强宿主植物的抵抗力以及诱导植物产生系统抗性等途径抑制病原菌生长繁殖[1-2]，植物内生菌已经成为开发生防农药不可忽视的资源。另外在长期与植物的协同进化中，通过基因的横向转移，内生菌还形成了与植物部分相同的代谢途径，参加植物次生活性物质的积累[3-5]，因此，植物内生菌也是天然活性物质的来源之一，药用植物内生菌有望在医药开发上作为发酵生产菌生产植物的药用成分。

野生艾蒿（Artemisia Argyi）是一种菊科蒿属多年生草本植物，也是传统的中药之一，其主要化学成分为挥发油类、黄酮类、桉叶烷类和三萜类等化合物，艾蒿中的黄酮类化合物具有抗氧化、清除自由基、抗癌和抑菌等多种生物活性[6]。国内外的研究表明，植物不同，从其组织中所分离到的内生菌的种类和数量不同，即使是同一种植物，因其所处的生境、气候特点、地理位置等因素的差异，从其组织器官中分离到的内生菌也会不同[7-9]。虽然徐亚军等[10]对河南商丘地区野生艾蒿内生菌的研究已有报道，但对气候和地理位置比较独特、药用植物道地性极为突出的商洛地区的艾蒿内生菌，目前尚未有研究报道。本研究从商洛野生艾蒿组织器官中分离内生细菌和内生真菌，并从中筛选出具有拮抗活性的菌株，旨在为医药生产、植物病虫害的防治和生物农药的研发提供有应用价值的菌种资源。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试植物

新鲜无病害野生艾蒿整体植株，于2019 年4 月27 日采自陕西省商洛市商州区金凤山，采样后装入保鲜袋内带回实验室，避光保存于4 ℃冰箱，2 d 内样品处理完毕。

1.1.2 供试指示菌

本研究的供试指示菌购自陕西省微生物研究所，供试细菌依次是金黄色葡萄球菌（Staphylococcus Aureus），枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis），大肠杆菌（Escherichia Coli）；供试植物病原菌依次是棉花枯萎病菌（Fusarium Oxysporum），茄病镰孢霉（Fusarium Solani），烟草赤星病菌（Alternaria Alternata）。

1.1.3 培养基

1）牛肉膏蛋白胨固体分离培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨 10 g、NaCl 5 g、琼脂 18 g、蒸馏水 1 000 mL、pH7.4～7.6；2）牛肉膏蛋白胨液体培养基（不加琼脂）；3）PDA 固体分离培养基：马铃薯 200 g、葡萄糖 20 g、琼脂 18 g、蒸馏水 1 000 mL、pH7.0 左右；4）PDA 液体发酵培养基：PDA 培养基不加琼脂。

1.2 艾蒿内生菌的分离

1.2.1 艾蒿内生细菌的分离

艾蒿内生细菌分离采用组织块法[11]。将采集来的新鲜艾蒿用自来水冲洗干净、晾干后剪成大小合适的组织块，在超净工作台中紫外灭菌20 min，然后在75%乙醇中浸泡1～2 min，无菌水冲洗5 次；0.1%升汞中浸泡1～3 min，无菌水冲洗5 次。

用灭过菌的解剖刀将上述灭菌后的大块组织按根、茎切去外皮后横切为0.5 cm 的小块，叶切为0.5 cm 的小片，用灭过菌的镊子分别将根、茎靠内侧切面和叶片贴向培养基接种于牛肉膏蛋白胨培养基上，每皿4 块，接种后的培养基置入28 ℃的恒温培养箱培养4～6 d。待接种组织块与培养基接种面边缘有菌落出现时，挑取位置、大小和形状等不同的单菌落，用平行划线法接入新鲜培养基，于28 ℃继续培养，待长出新菌落后，根据菌落形态与颜色的不同，再次挑取菌落进行纯化，反复纯化至单一菌种保存于4 ℃冰箱备用。

为了判断组织块表面消毒是否彻底，分别取最后一次冲洗组织块的冲洗液0.5 mL 涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上，并于相同条件下培养作为对照。若无菌落长出则表明消毒彻底，否则分离到菌株不能证明是内生菌，弃之不用。

1.2.2 艾蒿内生真菌的分离

艾蒿内生真菌的分离基本同内生细菌。所不同的是，组织块接种于PDA 培养基上，对照组冲洗液也涂布于PDA 培养基。待培养后接种面边缘有菌丝长出时，用尖端菌丝挑取法[12]挑取位置、颜色和形态不同的单菌丝接种于新鲜PDA培养基，反复纯化得到单一菌株。

1.3 内生菌在艾蒿中的分布统计

分别统计总组织块数、分离到菌株的组织块数、每个组织块中分离到的菌株数、每组组织块中分离到的菌株数、总分离到的菌株数。分别计算定殖率、分离率[13]：

定殖率=分离出菌株的组织块数/总组织块数

分离率=每组组织块中分离到的菌株数/总分离到的菌株数

1.4 分离内生菌的形态学观察

将分离纯化得到的内生细菌接种在牛肉膏蛋白胨培养基上，28 ℃下培养4～6 d 后，用肉眼观察菌落的形态、大小、颜色、透明程度、边缘和突起等特征。通过革兰氏染色，在油镜下观察细菌的形状和特征。

1.5 拮抗性内生细菌的筛选

拮抗性内生细菌的筛选采用纸片法[14]：内生细菌接种于100 mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行摇瓶振荡培养4 d，制得发酵液。靶标菌（金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌和大肠杆菌）接种于牛肉膏蛋白胨琼脂斜面上培养后制成菌悬液，取0.1 mL 菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨平板中制成含菌平板。用无菌镊子将滤纸片浸入内生菌发酵液中，取出并在瓶内壁除去多余的菌悬液，将纸片放到接好靶标菌的平板上，每个处理3 个重复，以无菌水代替发酵液浸泡滤纸片作对照，在28 ℃培养48～72 h 后，用十字交叉法测量抑菌圈大小，计算抑菌带宽度：

抑菌带宽度=（抑菌圈直径-测量菌直径）/2。

1.6 拮抗性内生真菌的筛选

拮抗性内生真菌的筛选采用菌饼对峙法[15]。在无菌条件下，打取病原菌菌饼接于PDA 平板培养基中央，另打取内生真菌菌饼接种于PDA 培养基平板距中央2.5 cm 处，以只接病原菌菌饼于平板中央为对照，在28 ℃恒温培养4 d 后，测量对照菌落和处理菌落直径，并计算抑菌率：

抑菌率=[（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径]×100%

2 结果与分析

2.1 野生艾蒿内生菌的分离结果

在牛肉膏蛋白胨培养基平板上共接种81 个组织块，其中根组织块34 个、茎组织块29 个、叶组织块18 个；分离到内生细菌35 株，其中在野生艾蒿根中分离到18 株，茎中分离到15 株，叶中分离到2 株；根茎叶内生细菌的定殖率、分离率见表1。

表1 野生艾蒿内生细菌的定殖率、分离率

从表1 中可以看出，野生艾蒿内生细菌在根中的定殖率、分离率分别是41.18%和51.43%，在茎中的定殖率、分离率分别是31.03%和42.56%，在叶中的定殖率、分离率分别是11.11%和5.71%。从定殖率与分离率来看，野生艾蒿根和茎中内生细菌含量较为丰富，这与任慧爽等[11]对桑树内生细菌多样性及内生拮抗活性菌群的研究结果基本一致。

本研究在PDA 平板上共接种69 个组织块，其中来自根组织块22 个，茎组织块24 个，叶组织块23 个；分离到内生真菌共19 株，其中在野生艾蒿根中分离到12 株，茎中分离到7 株，叶中未分离到内生真菌；根茎叶中内生真菌的定殖率、分离率见表2。

表2 野生艾蒿内生真菌的定殖率和分离率

从表2 中可以看出，野生艾蒿内生真菌在根中的定殖率、分离率分别是36.36%和63.16%，在茎中的定殖率、分离率分别是16.67%和36.84%，在叶中的定殖率、分离率均为0。说明商洛野生艾蒿内生真菌主要分布在根和茎中，并且野生艾蒿根中的内生真菌含量高出茎中近2 倍。

分离的内生细菌和内生真菌在野生艾蒿中的分布情况和菌株编号，分别见表3 和表4。

表3 野生艾蒿内生细菌的分布

表4 野生艾蒿内生真菌的分布

从表3、表4 分别可以看出，野生艾蒿中内生细菌和内生真菌在不同部位的分布表现既差异又相似的规律。内生细菌在艾蒿的根、茎和叶中分布比例分别为51.43%、42.56%和5.71%；内生真菌在艾蒿的根、茎和叶中分布比例分别为63.16%、36.84%和0，从中可以看出，商洛野生艾蒿植物中内生细菌、真菌的数量分布均表现为根中最高，茎中次之，叶中最少。

2.2 分离菌株形态学观察

对分离获得的35 株内生细菌进行了菌落形态、革兰氏染色、菌株个体形态鉴定，结果见表5。

表5 内生细菌的形态特征

2.3 拮抗性内生菌筛选

2.3.1 拮抗性内生细菌

采用纸片法，以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌为供试靶标菌，经反复筛选，得到4 株具有明显拮抗性的内生细菌，其中BS-6 和BR-6 菌株对枯草芽孢杆菌具有拮抗性；BR-9和BS-12 菌株对大肠杆菌具有拮抗性。

图1 是将枯草芽孢杆菌稀释涂布于A、B 平板中，a 为用无菌水浸过的滤纸片，b 为用含BS-6的菌悬液浸过的滤纸片，c 为用含BR-6 的菌悬液浸过的滤纸片，与对照相比可以看出，b、c 均有明显的抑菌圈，c 的抑菌圈更大，说明BS-6 和BR-6 菌株对枯草芽孢杆菌具有较强拮抗作用。抑菌带宽度分别为 0.81±0.1 cm 和 1.64±0.1 cm（表 6）。

图2 是将大肠杆菌稀释涂布于A、B 平板中，a 为用无菌水浸过的滤纸片，b 为用含BR-9的菌悬液浸过的滤纸片，c 为用含BS-12 的菌悬液浸过的滤纸片，与对照相比可以看出，B 平板中的b、c 均有明显的抑菌圈，说明两者对大肠杆菌均有拮抗作用，抑菌带宽度分别为0.93±0.1 cm和 0.86±0.1 cm（表7）。

图1 BS-6和BR-6 菌株对枯草芽孢杆菌的拮抗作用

图2 BR-9 和BS-12 菌株对大肠杆菌的拮抗作用

表6 BS-6 和BR-6 菌株对枯草芽孢杆菌的拮抗性效果

表7 BR-9 和BS-12 菌株对大肠杆菌的拮抗性效果

2.3.2 拮抗性内生真菌的筛选

采用平板两点对峙法，以棉花枯萎病、烟草赤星病、茄病镰孢霉为病原菌，对分离到的19 株内生真菌进行病原菌抗性筛选。结果表明，有2 株内生真菌有拮抗性，其中FR-4 菌株对茄病镰孢霉具有拮抗性，但对棉花枯萎病菌和烟草赤星病菌无拮抗性。FS-8 菌株对棉花枯萎病菌具有拮抗性，但对茄病镰孢霉和烟草赤星病菌无拮抗性。

图3 中将含茄病镰孢霉的菌饼置于A、B 平板a 的位置，含FR-4 菌株的菌饼置于B 平板b的位置，培养一段时间后发现，A 图的茄病镰孢霉生长良好，而从B 图可以明显的看出茄病镰孢霉的菌丝生长受到FR-4 菌株的抑制，产生了月牙形状，分别测定对照菌落直径、处理菌落直径，计算出FR-4 菌株对茄病镰孢霉的抑菌率达38.61%（表8），表现出较强的拮抗作用。

图3 FR-4 菌株对茄病镰孢霉的拮抗性作用

图4 中将棉花枯萎病菌的菌饼置于A、B 平板a 的位置，含FS-8 菌株的菌饼置于B 平板b的位置，培养一段时间后发现，A 图的棉花枯萎病菌生长良好，而B 图的棉花枯萎病菌的菌丝扩展受到FS-8 菌株的抑制，使得棉花枯萎病菌的右侧区域凹陷进去，不再向四周扩展。测出FS-8菌株对棉花枯萎病菌的抑菌率为31.34%（表 8）。

图4 FS-8 菌株对棉花枯萎病菌的拮抗性作用

表8 FR-4 和FS-8 菌株对植物病原菌的抗菌效果

3 结论与讨论

本研究从商洛野生艾蒿根、茎、叶中共分离到54 株内生菌，其中内生细菌35 株，内生真菌19 株，分离到的内生细菌、真菌的含量分布均表现为：根部最多，茎中次之，叶部最少。以金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，大肠杆菌为指示菌对分离内生细菌的拮抗性进行了测定，筛选得到4株具有明显抗菌作用的菌株，分别是菌株BS-6和BR-6 对枯草芽孢杆菌具有明显的抗菌作用，抑菌圈直径分别为 2.34±0.1 cm 和 4.10±0.1 cm。菌株BR-9 和BS-12 对大肠杆菌的抑菌效果均较明显，抑菌圈直径分别为2.60±0.1 cm 和2.41±0.1 cm；以棉花枯萎病菌，茄病镰孢霉，烟草赤星病菌为供试植物病原菌，对分离的内生真菌的拮抗性进行了测定，筛选得到2 株具有明显抗菌作用的菌株，分别是FR-4 菌株对茄病镰孢霉具明显的拮抗作用，抑菌率达38.61%，FS-8 菌株对棉花枯萎病菌具有明显的拮抗作用，抑菌率为31.34%。这表明内生菌在野生艾蒿中分布比较丰富，具有拮抗活性的菌株比例和拮抗活性都比较高。

内生菌普遍存在于植物组织中，但从不同植物体内分离得到的内生菌数量和种类有所差异，即使是同一种植物，也会因生境、品种和年龄等的不同而分离出不同数量和种类的内生菌。如徐亚军等[10]从河南商丘地区野生艾蒿的根茎叶部位分离出内生细菌共68 株，筛选获得对病原菌抑制效果最明显的3 株菌并对其进行了分子水平的分类和鉴定。马长乐等[16]从云南榧的新鲜茎与叶中分离得到10 株内生真菌和5 株内生放线菌，发现2 株内生真菌和2 株内生放线菌对植物病原菌均表现出了较强的抑菌活性。杜晓宁等[17]从宁夏枸杞各药用组织器官中分离出内生细菌34 株，隶属于 7 科 11 属，内生细菌的数量和群落组成存在明显的组织特异性，且遗传多样性丰富，对植物病原菌有较强的抑制活性。从不同植物不同环境下分离到的内生菌数量、类型和拮抗性大小不同，正说明了植物内生菌是一个极其丰富的群体，其中蕴藏着对人类有用的各种功能性菌种资源，值得人们进行广泛的研究开发。

根据现有的研究，内生菌寄生于植物中与植物之间形成了一种协同进化、互惠互利的关系[18-19]，对于药用植物而言，内生菌对植物的作用表现为三个方面，其一可能通过分泌生长素，促进植物的生长；二是参与植物有效活性成分合成的部分代谢，有利于药用植物活性成分的积累；三是寄生于植物组织中抑制植物病原菌，防止病原菌侵染和病虫害的发生[20]。艾蒿是传统的中药材，具有活血通络止疼、抗菌消炎驱虫等功效。医学和中药材抗菌试验中一般通用的指示菌为金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌和大肠杆菌，本研究中分离到的拮抗性内生细菌具体的抑菌机理虽然还有待深入研究，但推测可能与艾蒿有效成分对指示菌的抑菌作用机理有共同之处。如果是一样的，分离到的内生细菌可能还可以作为医药的生产菌种用于工业发酵中生产艾蒿活性物质。

关于内生菌在防治植物病原菌侵害方面的研究，以前都广泛集中于内生真菌对植物病原菌的抵抗方面，近几年有不少内生细菌对植物病原菌抑制作用的研究。由于植物病原菌大多数为真菌，内生细菌一般是通过分泌抑菌物质对植物病原菌产生抑制的，而内生真菌对植物病原菌的抑制除可能分泌某种抑菌物质外，主要是通过空间占位、营养竞争和溶解菌丝等达到对病原菌抵抗的。本研究筛选到的2 株内生真菌抵抗植物病原菌作用明显，FR-4 菌株对茄病镰孢霉抑菌率达38.61%，FS-8 菌株对棉花枯萎病菌的抑菌率为31.34%，2 株菌都有作为生防菌种应用于农业生产中的潜力。

本研究对分离的内生真菌未进行鉴定，对内生细菌只从形态上作了初步鉴定，对内生细菌和真菌的抑菌作用机理也只从抑菌现象上进行了分析，对分离的内生细菌是否对植物病原菌也有拮抗作用未进行测定，下一步将研究内生细菌对植物病原菌的拮抗作用，结合形态学特征及细菌16S rRNA 序列的系统进化分析确定筛选到的拮抗内生菌的具体种属类型[21]，并提取和分析内生菌产生的拮抗性代谢物质，深入研究其拮抗作用。