Survivin和EphA2蛋白在脑膜瘤组织中的表达及预后关系

苏 辉，程宏伟，洪文明

在原发性脑部肿瘤中，约1/5～1/4为脑膜瘤，有部分脑膜瘤表现为恶性肿瘤特点，具有复发性、侵袭性和远处转移[1]。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)存活素(Survivin)可阻断执行凋亡的蛋白裂解酶Caspases-3等，导致肿瘤细胞增殖和发展[2]，Survivin的表达与脑膜瘤的级别和复发是否相关，能否作为预测肿瘤复发和临床预后的指标目前仍存在争议[3]。上皮细胞激酶(epithelial cell kinase，EphA2)是血管生成拟态(vasculogenic mimicry，VM)相关的信号通路重要蛋白，有研究证实，抑制消化系统肿瘤[4]、黑色素瘤[5]细胞中Survivin、EphA2蛋白的表达可抑制VM形成。Survivin蛋白表达与脑膜瘤[6]、EphA2蛋白表达与脑膜瘤[7]的关系已有文献报道，但有关联合检测凋亡抑制蛋白Survivin和VM形成中EphA2蛋白在脑膜瘤中的表达及意义文献报道较少。该研究检测最近4年里62例不同级别脑膜瘤患者中Survivin、EphA2蛋白的表达特点，分析其脑膜瘤预后中的价值。

1 材料与方法

1.1 病例资料62例患者为2014年2月～2018年7月均因进行性加重的头痛等症状入住安徽医科大学第一附属医院神经外科，且结合脑部磁共振诊断为脑膜瘤，手术后均经病理学证实。按照WHO脑膜瘤病理分级，其中34例为Ⅰ级，17例为Ⅱ级，11例为Ⅲ级；患者性别：27例为男性，35例为女性；患者年龄40～77(52.9±13.2)岁。患者均为首发病例，无其他较为严重的合并症。患者对研究均知情同意，并签署协议书。

1.2 主要试剂一抗：羊抗人Survivin多克隆抗体、羊抗人EphA2多克隆抗体购于美国Santa Cruz生物技术公司；免疫组织化学SP和DAB显色试剂盒购于北京中杉金桥有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 免疫组化染色及结果判断采取免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法(streptavidin-peroxidase method,SP法)检测Survivin、EphA2蛋白表达，步骤如下。手术切除脑膜瘤组织，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，厚4 μm切片，二甲苯脱蜡，微波抗原修复，3%H2O2消除内源性过氧化物酶，羊血清封闭抗原。滴加羊抗人多克隆一抗(Survivin，1 ∶200稀释；EphA2，1 ∶300稀释)，4 ℃孵育过夜。次日，滴加兔抗羊二抗50 μl；DAB显色，苏木素复染，中性树胶封固后镜检。Survivin、EphA2免疫组化结果由2名病理科医生独立判定，细胞质呈棕黄色或棕褐色判定为阳性细胞。按照文献[8]方法：① 阳性染色程度计分，阴性“-”： 染色较浅，0分；弱阳性“+”：呈浅黄色，1分；阳性“”：呈黄色，2分；强阳性“”：呈棕褐色，3分。② ×200倍显微镜下随机记录500个细胞，计算阳性染色细胞占总细胞的百分比，0～10%，0分；11%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；>75%，4分。将Survivin、EphA2蛋白的两组数值相加以表示浓度分布评分( intensity distribution score，IDS)，IDS为0时，为阴性，将患者以IDS积分分为两组，低表达组：0～3分；高表达组：4～7分。

1.4 Western blot检测脑膜瘤组织中Survivin、EphA2蛋白表达随机取手术切除脑膜瘤组织，每组5例，超低温冰箱冻存。行蛋白免疫印迹检查时，加入蛋白裂解液，将脑膜瘤组织研磨呈粉状，超声细胞破碎仪反复破碎，离心，BCA 法测定样品蛋白浓度。行SDS-PAGE电泳，上样量为20 μg总蛋白，加入羊抗人多克隆抗体(Survivin，1 ∶2 000稀释；EphA2，1 ∶2 500稀释)，4 ℃孵育过夜，次日，二抗孵育，ECL化学发光显影，曝光，灰度分析采用Image J软件，以GAPDH为内参，目标蛋白相对表达水平采用Survivin、EphA2蛋白和GAPDH比值表示。

2 结果

2.1 Survivin、EphA2蛋白表达与脑膜瘤一般情况比较应用浓度分布评分(IDS)比较两种蛋白表达与脑膜瘤一般资料情况，低表达组(0～3分)与高表达组(4～7分)与患者性别、年龄、饮酒、吸烟、肿瘤部位等差异无显著性(表1)。

2.2 Survivin和EphA2蛋白在不同病理分期脑膜瘤组织中的表达脑膜瘤临床中主要分为Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级，Survivin、EphA2蛋白在不同级别脑膜瘤组织中的表达免疫组织化学染色结果见图1、2。随着病理分级水平的升高，非参数秩和检验相关分析显示，Survivin和EphA2蛋白在脑膜瘤组织中升高，两组呈正相关(F=3.627，P<0.05)，见表2。

2.3 脑膜瘤患者预后与Survivin与EphA2蛋白表达的关系术后62例脑膜瘤患者均获得随访，时间为6～36(12.8±4.6)个月，统计不良预后(复发+死亡)患者病例数；本组不良预后9例(7例复发，2例死亡)，与未复发病例的Survivin IDS值(2.09±1.05)、EphA2 IDS值(2.52±1.21)比较，复发患者的Survivin IDS值(5.62±1.83)、EphA2 IDS值(5.35±1.72)，两组之间比较差异有统计学意义(F=8.361、7.264，P<0.01)，见图3。提示Survivin IDS值与EphA2 IDS值升高，脑膜瘤患者可能预后不良。

表1 比较Survivin和EphA2表达IDS值与脑膜瘤患者一般情况(n)

图1 脑膜瘤组织中Survivin蛋白表达 ×400

A：脑膜瘤旁正常脑组织(-)表达；B：Ⅰ级脑膜瘤组织中(+)表达；C：Ⅱ级脑膜瘤组织中()表达；D：Ⅲ级脑膜瘤组织中()表达

图2 脑膜瘤组织中EphA2蛋白表达 ×400

A：脑膜瘤旁正常脑组织(-)表达；B：Ⅰ级脑膜瘤组织中(+)表达；C：Ⅱ级脑膜瘤组织中()表达；D：Ⅲ级脑膜瘤组织中()表达

表2 Survivin与EphA2蛋白在不同分期脑膜瘤组织中表达

图3 脑膜瘤患者复发情况与Survivin与EphA2蛋白表达IDS值的关系与未复发组比较：**P<0.01

2.4 蛋白免疫印迹法检测Survivin和EphA2蛋白在不同分期脑膜瘤中的表达随机选择5例不同病理分级脑膜瘤组织，Western blot结果表明，Ⅰ级脑膜瘤组织中Survivin和EphA2蛋白的表达较弱，随着病理分期升高，Survivin和EphA2蛋白的表达增强，见图4A。由图像分析可知，与Ⅰ级脑膜瘤组织比较，高分期的Ⅱ级和Ⅲ级脑膜瘤组织中Survivin /GAPDH和EphA2/GAPDH比值明显升高，见图4B。

图4 蛋白免疫印迹检测Survivin和EphA2蛋白在不同分期脑膜瘤组织中的表达

A：Western blot结果；B：蛋白半定量统计图；1：Ⅰ级脑膜瘤组织；2：Ⅱ级脑膜瘤组织；3：Ⅲ级脑膜瘤组织；与Ⅰ级脑膜瘤比较：*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

脑膜瘤早期，肿瘤往往生长缓慢，患者病情隐匿，若有典型的头疼、癫痫等症状时，病情已为晚期。虽然脑膜瘤恶性程度不高，但其具有侵袭性、异常增殖、术后患者易复发的特征，且脑膜瘤组织中富含血管，常呈结节状嵌入大脑半球中[9]。Caspases-3系具有激活半胱氨酸和裂解底物位点的蛋白裂解酶，可导致细胞凋亡，Survivin 属于凋亡抑制蛋白家族，功能多样，参与细胞凋亡、分裂和老化，Survivin可阻断Caspases-3蛋白裂解酶，抑制肿瘤细胞凋亡[10]。研究[11]表明，高表达Survivin提示肿瘤患者预后不良或药物抵抗，而抑制肿瘤细胞中Survivin表达可抑制肿瘤增殖，诱导肿瘤凋亡。由此提示Survivin在脑膜瘤细胞增殖和信号转导通路中发挥功能。

近年来的研究[12]表明，肿瘤细胞的生长中常出现VM，中胚层的血管间叶组织代替内胚层起源的上皮细胞，形成肿瘤细胞上皮-间质转化。肿瘤细胞的血管生成拟态是指肿瘤细胞围成条管道样结构，可以模拟血管作用，但没有血管内皮细胞形成，在这些无内皮细胞管道样结构中，血液可以在其中流动，从而供给肿瘤组织营养，故抗新生血管的分子靶向治疗成为近年来抗肿瘤药物研发的一个重要课题。实体瘤脑膜瘤的生长过程需要丰富的血供，血管为其生长和侵袭提供充足的营养和氧，对脑膜瘤血管新生机制的研究有望成为有效的减少脑膜瘤复发和分子靶向治疗的依据。研究[13]表明，上皮细胞激酶(EphA2)是VM相关的信号通路蛋白，作为受体蛋白酪氨酸激酶，EphA2在血管生成方面起重要的调节作用，抑制EphA2的表达，在临床治疗胰腺癌中已取得一定的疗效。本研究应用免疫组织化学和蛋白免疫印迹法均证实EphA2在高级别的脑膜瘤中表达更为明显，与脑膜瘤的复发呈正相关。

该研究由于病例数，尤其是Ⅱ级和Ⅲ级脑膜瘤较少，在分析中可能会存在偏倚；同时，随访时间不够，有待进一步收集病例和延长随访时间。总之，调控细胞增殖和凋亡的关键蛋白Survivin以及VM相关蛋白EphA2在恶性程度较高的Ⅲ级脑膜瘤中高表达，两者联合检测可作为肿瘤治疗的理想靶点。同时，该研究发现Survivin和EphA2蛋白的表达水平与脑膜瘤患者的预后有关，故两者的深入研究为精准治疗脑膜瘤的提供新的可能，值得进一步研究。