盐酸小檗碱对肝纤维化大鼠肠道黏膜屏障的保护作用及机制

李 震，刘 伟，候桂琴

肝纤维化是多种慢性肝病进展的共同病理过程，是我国严重的公共卫生问题，同时也是患者进展为肝硬化甚至死亡的主要病因[1-2]。肝纤维化的发病机制十分复杂，传统研究普遍认为肝脏纤维化的形成主要包括肌成纤维细胞的形成和细胞外基质沉积两个连续的过程。但近年研究[3-4]显示肝纤维化与肠道黏膜屏障损伤有关。研究[5-7]表明，盐酸小檗碱具有抑菌和改善肠道菌群的作用，但尚不确定其是否对肠道屏障有保护作用。基于此，该实验拟通过肝纤维化模型探讨盐酸小檗碱对肝纤维化肠道黏膜屏障的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物 健康SPF级雄性SD大鼠，40只，体质量为200～220 g,由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号:SCXK(鄂)2015-0018。

1.1.2主要药品及试剂 CCl4购自上海展云化工有限公司，批号20180112；盐酸小檗碱购自吉林省临江市健今药业有限责任公司，批号20180412；果糖口服溶液购自莱阳江波制药有限责任公司，批准文号：国药准字H20074010，生产批号：180721；丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)生化试剂盒购自南京建成生物技术有限公司，批号分别为20180712、20180614、20180523。大鼠透明质酸(hyaluronic acid，HA)、层粘连蛋白(laminin，LN)、IV型胶原蛋白(type IV collagen, IV-C)及内毒素ELISA试剂盒、二抗(HRP标记山羊抗大鼠抗体)、内参(β-actin)均购自武汉巴菲尔生物技术有限公司，批号分别为1800405、180610、180326、180617、20180528、20180412；Takara逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq[TM]购自大连Takara公司，批号分别为M9004、A2801；闭合蛋白(Claudins)、闭锁连接蛋白-1(zonula occludens-1，ZO-1)为兔抗鼠抗体，购自英国Abcam公司，批号分别为ab216327、ab150077。

1.1.3主要仪器 AE224型分析天平购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司；FastTrackTM型紫外分光光度计购自上海梅特勒-托利多有限公司；Genova Bio型核酸蛋白分析仪购自苏州艾泰赫生化科技有限公司；9700型PCR扩增仪购自美国ABI公司；WD-9413C型凝胶成像分析系统购自北京六一仪器厂。

1.2 方法

1.2.1动物分组 适应性饲养1周后将大鼠随机分为正常对照组(control group,CON组)、模型组(model group,MOD组)、乳果糖口服液组(lactulose oral liquid group,LOL组)和盐酸小檗碱组(berberine hydrochloride group,BH组)，每组10只，除CON组外，其他各组制作肝纤维化模型。

1.2.2肝纤维化模型的建立 参考文献[6]制作肝纤维化模型：MOD组、LOL组和BH组按0.1 ml/100 g的剂量腹腔注射50% CCl4橄榄油溶液,2次/周，共12周。CON组按0.1 ml/100 g的剂量腹腔注射橄榄油溶液，2次/周，共12周。

1.2.3给药 灌胃和给药同时进行，每天上午定时造模，下午定时给药，即LOL组按100 mg/kg的剂量灌胃乳果糖口服溶液，BH组按150 mg/kg的剂量灌胃盐酸小檗碱药液，灌胃容积均为10 ml/kg，CON组和MOD组按10 ml/kg的剂量灌胃生理盐水，连续灌胃12 周，1次/d。

1.2.4指标检测

1.2.4.1 肝脏指数和脾脏指数 末次灌胃结束后24 h取材，称重，用10%水合氯醛溶液按0.3 ml/100 g的剂量麻醉，麻醉好后经腹主动脉取血，分离肝脏和脾脏，剥离脂肪韧带，擦干血水，称取肝脾重量，计算脏器指数，脏器指数=脏器质量(g)/体质量(g) ×100%。

1.2.4.2 血清酶检测 采血后离心取上清液，检测各组大鼠血清酶的表达水平，检测步骤按照各指标的说明书进行。

1.2.4.3 血清HA、LN、IV-C及血清内毒素检测 采血后离心取上清液，用ELISA检测各组大鼠HA、LN、IV-C和内毒素的表达水平，检测步骤按照各指标的说明书进行。

1.2.4.4 肝脏和肠道病理学检测 称重后，取肝右叶和回肠，置4%多聚甲醛固定48 h,用HE染色观察肝脏和回肠的病理改变。

1.2.4.5 RT-PCR检测回肠中Claudins、ZO-1 mRNA表达水平 用RT-PCR检测检测回肠中Claudins、ZO-1 mRNA表达水平。取血后，分离回肠，称取50 mg。参照TRIzol说明书提取回肠总mRNA，用核酸蛋白仪检测纯度，纯度为1.8～2.2即可进行下一步；按照Takara逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA，按照SYBR Premix Ex Taq[TM]试剂盒说明书依次添加试剂，用PCR仪进行基因扩增。每个基因重复3次，用2-△△Ct表示mRNA相对表达水平。Claudins、ZO-1及内参β-actin序列见表1。

表1 引物序列

1.2.4.6 Western blot检测回肠中Claudins、ZO-1的蛋白表达 用Western blot检测4组大鼠回肠中Claudins、ZO-1的蛋白表达量，内参为GAPDH。取肺组织50 mg,加蛋白裂解液,冰上研磨，以4 ℃、12 000 r/min离心30 min，取上清液，用BCA蛋白质试剂盒分别测定4组蛋白量；依次加样、凝胶电泳、转膜和室温封闭；按抗体说明书加入一抗Claudins(1 ∶300)和一抗ZO-1(1 ∶200)，置4 ℃冰箱过夜，洗膜，再加入二抗(1 ∶1 000)，ECL显色；置于凝胶图像成像分析系统，曝光各组蛋白条带，拍照。

2 结果

2.1 肝脏指数和脾脏指数与CON 组相比，MOD组大鼠肝脏指数和脾脏指数都明显升高(P<0.01)；与MOD组相比，LOL组和BH组大鼠肝脏指数和脾脏指数均有不同程度降低(P<0.01，P<0.05)，其中BH组下降最为明显。见表2。

2.2 血清酶的检测结果与CON组相比，MOD组大鼠血清中ALT、AST、ALP明显升高(P<0.01)；MOD组相比，LOL组和BH组大鼠血清中ALT、AST、ALP均有不同程度降低(P<0.01，P<0.05)，其中BH组下降最为明显，见表3。

2.3 血清HA、LN、IV-C及血清内毒素检测结果

表2 各组大鼠肝脏指数和脾脏指数检测结果

与CON 组比较：**P<0.01；与MOD组比较：#P<0.05，##P<0.01

表3 各组大鼠血清酶检测结果

与CON 组比较：**P<0.01；与MOD组比较：#P<0.05，##P<0.01

与CON组相比，MOD组大鼠血清中HA、LN、IV-C及内毒素明显升高(P<0.01)；与MOD组相比，LOL组和BH组大鼠血清中HA、LN、IV-C及内毒素均有不同程度降低(P<0.01，P<0.05)，其中BH组下降最为明显，见表4。

2.4 病理组织学结果肝脏HE染色：CON组大鼠肝细胞大小均匀，排列整齐，肝索和肝小叶结构完整且排列整齐。MOD组大鼠肝细胞大小不一，排列紊乱，肝小叶和肝索结构紊乱，可见气球样变、空泡样变和炎性细胞浸润。LOL组和BH组大鼠肝细胞、肝小叶、肝索的病理形态都明显优于MOD组，也存在少量的炎性细胞浸润。见图1。回肠 HE 染色：CON组大鼠回肠肠绒毛结构较完整、整齐排列，未见绒毛脱落、倒伏的现象，上皮黏膜间无明显炎性细胞浸润。MOD组大鼠回肠有绒毛排列紊乱，绒毛变短，肠黏膜充血、水肿，存有明显的炎性细胞浸润。LOL组和BH组回肠肠黏膜充血、水肿及炎性细胞浸润明显改善。见图2。

2.5 RT-PCR检测结果CON组大鼠回肠中Claudins、ZO-1 mRNA表达水平较高，造模后，MOD组大鼠回肠中Claudins、ZO-1 mRNA表达水平降低(P<0.01)，给药后，LOL组和BH组大鼠回肠中Claudins、ZO-1 mRNA表达水平升高(P<0.05)，其中BH组上升最为明显。见表5。

2.6 Western blot检测结果CON组大鼠回肠中Claudins、ZO-1蛋白表达水平较高，造模后，MOD组大鼠回肠中Claudins、ZO-1蛋白表达水平降低(P<0.01)，给药后，LOL组和BH组大鼠回肠中Claudins、ZO-1蛋白表达水平升高(P<0.01，P<0.05)，其中BH组上升最为明显。见表6、图3。

表4 各组大鼠血清HA、LN、IV-C及血清内毒素检测结果

与CON 组比较：**P<0.01；与MOD组比较：#P<0.05，##P<0.01

图1 各组大鼠肝组织HE染色结果 ×400A：MOD组；B：CON组；C：LOL组；D：BH组

图2 各组大鼠回肠HE染色结果 ×400A：MOD组；B：CON组；C：LOL组；D：BH组

表5 各组大鼠回肠中Claudins、ZO-1 mRNA的表达水平

与CON 组比较：**P<0.01；与MOD组比较：#P<0.05，##P<0.01

表6 各组大鼠回肠中Claudins、ZO-1的灰度值

与CON 组比较：**P<0.01；与MOD组比较：#P<0.05，##P<0.01

图3 各组大鼠回肠中Claudins、ZO-1蛋白条带图A：CON组；B：MOD组；C：LOL组；D：BH组

3 讨论

CCl4是动物实验中诱导肝纤维化最广泛使用的药物，一般而言，腹腔注射吧CCl415 min后即可造成肝损伤，48 h肝损伤达高峰，此后肝脏进入修复期，因此给药3～4 d就可形成肝纤维化[8]。该实验每周2次腹腔注射50% CCl4橄榄油溶液，连续造模12周。肝脏HE染色结果显示，MOD组大鼠肝细胞大小不一，排列紊乱，肝小叶和肝索结构紊乱，可见气球样变、空泡样变和炎性细胞浸润。ALT、AST、ALP是评价肝功能的重要指标，该研究显示，造模后模型组大鼠血清中ALT、AST、ALP明显升高(P<0.01)。肝纤维化是许多慢性肝病的共同病理过程，肝脏细胞外基质(extracellular matrix，ECM)弥漫性沉积为其主要病理特征[9-10]。ECM的主要成分是胶原，IV-C是ECM的重要成分之一，而HA和LN是IV-C形成的主要成分，因此IV-C、HA和LN对于肝纤维化的诊断具有重要意义。该实验表明，MOD组大鼠血清中IV-C、HA和LN的含量明显高于CON组。综合HE染色结果、血清酶检测结果和IV-C、HA、LN检测结果，该实验成功通过CCl4诱导建立了肝纤维化大鼠模型。

肠道黏膜屏障主要由机械屏障、免疫屏障、化学屏障和生物屏障四部分组成，是防止肠道内有害物质和病原体进入机体内环境，并维持机体内环境稳定的一道重要屏障。该屏障中任何一功能出现紊乱，均可引发细菌和内毒素的异位。

研究[11]表明肝纤维化中有明显的肠道机械屏障损伤。肠道机械屏障损伤主要表现为肠道通透性增高。肠道黏膜机械屏障由肠上皮细胞及细胞间的紧密连接蛋白构成，因此肠道黏膜上皮间的紧密连接(tight junctions，TJ)对于维持肠道黏膜机械屏障的完整性尤为关键[12]。TJ由许多紧密连接蛋白组合构成，如咬合蛋白(occludin)、闭合蛋白(Claudin家族)和闭锁连接蛋白(zonula occludens, ZOs)，其中Claudins和ZO-1最具代表，二者常被视为肠道机械屏障的核心指标[13]。Claudins蛋白对肠道黏膜机械屏障起决定性作用，主要存在于肠道上皮细胞间的TJ，一般情况下仅允许小分子进入。ZO-1的氨基端与Claudins羧基端相连，可将Claudins与细胞骨架连接起来[14]。Claudins和ZO-1相互连接构成肠道黏膜机械屏障，二者表达减少时会导致肠道黏膜的通透性增加，从而使肠道黏膜的保护作用减弱[15]。该实验表明，MOD组大鼠回肠有绒毛排列紊乱，绒毛变短，肠黏膜充血、水肿，存有明显的炎性细胞浸润，同时回肠中Claudins、ZO-1 mRNA和蛋白表达水平明显降低，因此，肝纤维化会伴随肠道机械屏障功能受损，其受损原因可能与回肠中Claudins、ZO-1的蛋白表达水平有关。

该实验显示盐酸小檗碱可以明显改善肝脏和回肠的病理特征，并能提高回肠中Claudins、ZO-1的mRNA和蛋白表达水平。这说明盐酸小檗碱对肝纤维化大鼠肠道黏膜屏障具有保护作用，其机制可能与其改善回肠中Claudins、ZO-1的表达有关。