超声波制备肝素苄基酯优化工艺研究

杨彬，王志耕

(安徽农业大学 茶与食品科技学院，安徽 合肥 230036)

依诺肝素钠是碱解聚伊诺肝素苄基酯制备而成的低分子肝素[1]，是目前抗凝、抗栓治疗的主要药物[2-3]。制备肝素苄基酯的酯化率与反应物浓度、温度及时间等因素相关[4]。传统工艺耗时长、成本高，需要20～35 h以上[5-8]。超声波反应温和，在传质、传热和化学反应等方面具有独特作用，已广泛应用于生物、化工、制造等领域[9]。本实验引入超声波制备肝素苄基酯，期望缩短反应时间、提高产率和酯化率，减少有机物的使用和残留，获得最优制备工艺。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

肝素钠，工业品；肝素钠标准品、多硫酸软骨素标准品均购自中国药品生物制品检定所；苯甲醇、高氯酸锂、苄索氯铵(97%)、磷酸、磷酸二氢钠、甲醇、氢氧化钠、醋酸钠、冰乙酸、二氯甲烷等均为分析纯；氯化苄、甲醇、乙腈均为优级纯。

ACQUITY UPLC H-CLASS 超高效液相色谱仪；Breeze 2 高压液相色谱仪；Specord S600紫外可见记录分光光度仪；MS205DU和 AL104型电子分析天平；3670离心机；KQ500DE型超声波清洗器；DZF-6090型真空干燥箱。

1.2 实验方法

1.2.1 粗品肝素钠的纯化 称取粗品肝素钠40 g，溶于含12 g氯化钠的400 mL去离子水溶液中。加入320 mL甲醇，搅拌、沉淀1 d。过滤。滤饼40 ℃真空干燥。测定蛋白核酸的紫外吸收值和多硫酸软骨素含量。

1.2.2 肝素季铵盐的制备 将纯化的19.4 g肝素钠溶于200 mL纯水中，注入含50 g苄索氯铵的250 mL水溶液中，搅拌并离心，用水不断冲洗，直到冲洗液变透明，获得肝素季铵盐，45 ℃真空干燥。

1.2.3 肝素苄基酯的制备 将1 g肝素季铵盐加入到5 mL二氯甲烷中，搅拌溶解。加入氯化苄1 mL，放入超声功率为400 W的超声波清洗器中，温度为35～40 ℃，超声反应5.5 h，做3个平行样。反应结束后，加入6 mL的10%醋酸钠甲醇溶液[4]，得肝素苄基酯沉淀，离心，用甲醇反复洗涤，直到无刺激性气味，于45 ℃真空干燥24 h。

1.3 多硫酸软骨素的检测

1.3.1 色谱条件[10]Waters Breeze 2高效液相色谱仪，Waters 2489紫外检测器，色谱柱TSK-GEL EDAE-5pw(75 mm ×2 mm，10 μm)，流动相A为2.5 mmol/L 磷酸二氢钠(用磷酸调节至pH 3.0，0.22 μL 滤膜)，流动相B为2.5 mmol/L磷酸二氢钠、1 mol/L高氯酸锂(用磷酸调节至pH 3.0，0.22 μL滤膜)，梯度洗脱方法：0～2 min，10%B-10%B；3～7 min，20%B-20%B；7～15 min：20%B-100%B；5～25 min：100%B-100%B；检测波长202 nm，柱温箱35 ℃，进样量10 μL，流速0.2 mL/min。

1.3.2 标准曲线绘制 配制0.40，1，1.7 mg/mL的多硫酸软骨素标液，经HPLC检测，绘制标准曲线。以浓度(mg/mL)为纵坐标(y)，以面积为横坐标(x)，回归方程为y=8×10-8x+0.258(R2=0.961)，结果表明硫酸软骨素溶液在0.4～1.7 mg/mL的浓度范围内线性关系良好。

1.3.3 样品分析 用超纯水配制成含20.0 mg/mL的原料肝素钠和纯化后的肝素钠溶液。以超纯水为溶剂，配制含1 mg/mL肝素钠标准品溶液。用HPLC测定多硫酸软骨素含量，与对照品溶液的标准品比较。纯化后的肝素钠中多硫酸软骨素含量必须小于总含量的2%。

1.4 肝素苄基酯含量分析

本研究将酯化率定义为肝素苄基酯水解后的苯甲醇质量与肝素苄基酯质量的百分比。

1.4.1 色谱条件 超高效液相色谱仪Waters Uplc Class超高效液相色谱仪，TUC detector检测器，色谱柱ACQUITY UPLC®BEH C18(1.7 μm 2.1 mm×50 mm)，流动相[11]为水∶乙腈∶甲醇=80∶15∶5，检测波长256 nm，柱温25 ℃，进样体积1 μL，流速0.5 mL/min，运行时间2 min。

1.4.2 标准曲线绘制 配制浓度0.5 mg/mL的苯甲醇标准储备液，稀释至0.05，0.07，0.1，0.15，0.175 mg/mL的工作液，过0.22 μL滤膜后进HPLC分析，苯甲醇浓度(mg/mL)为横坐标(x)，以测得的峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线，得到回归方程y=182 307x-227.79，R2=0.999 9，表明甲醇溶液在0.05～0.175 mg/mL线性相关性好，根据该标准曲线可以对水解液中的苯甲醇进行定量分析。

1.4.3 样品分析 取0.125 g肝素苄基酯于25 mL容量瓶中，加入1 mol/L NaOH溶液5 mL，室温反应1 h。加1 mL冰醋酸，终止反应。加水定容至25 mL，使得肝素苄基酯的终浓度为5 mg/mL[12-13]。取1 μL按照上述HPLC条件测定样品中苯甲醇的峰面积，经回归方程测得其浓度，计算酯化率。

酯化率=(C2/C1)×100%

“我很高兴自己能驾驶这辆沃尔沃P1800通勤这么多年，它也从未因故障把我落在路边。我希望能一直就这么开着它，直到有一天我离开人世。其实，它的状态远比我的身体状态要好很多。”

式中，C1为待测样品肝素苄基酯的质量浓度，C2为待测液中苯甲醇的质量浓度。

2 结果与讨论

2.1 肝素钠粗品纯化后的杂质分析

肝素主要分布在动物细胞的肥大组织中，与蛋白质结合形成复合物，而这种复合物无抗凝血活性，蛋白质去除后肝素的抗凝活性才得以体现[14]。目前主要通过酶水解、盐析等方法去除原料肝素钠中的蛋白质，得到肝素钠粗品。因经酶水解后的肝素钠原料中蛋白质被分解为多肽，且含有如硫酸软骨素类的杂质，又不易在高温，强酸强碱等情况下去除蛋白质，易使肝素钠失去活性。肝素的纯化一般为氧化法，加双氧水、高锰酸钾等，得率低，且影响活性。粗品肝素钠40 g经纯化后得到为19.7 g肝素钠，测定结果见图1、图2。

图1 0.4 mg/mL 原料液波段扫描图Fig.1 Band scan figure of crude heparin solution at 0.4 mg/mL

图2 纯化后0.4 mg/mL肝素钠溶液波段扫描图Fig.2 Band scan figure of purified heparin solution at 0.4 mg/mL

由图1、图2可知，粗品肝素钠在A260、A280的吸收值为2.937 1和1.650 9，纯化后为0.374 6和0.218 4。用甲醇纯化石，蛋白质和核酸含量明显降低，粗品肝素钠在180～200 nm处有很多的杂峰，经纯化后，峰型单一，在A190处有肝素钠的特征性吸收峰。整个纯化过程温和且没有引入新杂质，起到了很好的除杂效果。

2.2 多硫酸软骨素的检测

多硫酸软骨素的结构、电荷密度、分子量、抗凝活性均与肝素相似，因此在肝素钠中发现OSCS较为不易。肝素钠中有关物质尤其是多硫酸软骨素的分析成了肝素类药物研究的重点和难点[15]，快速检出掺杂了OSCS的肝素钠是提高肝素钠相关产品安全性和质量标准的关键。各溶液测定结果见图3。

图3 各物质的液相色谱图Fig.3 Liquid chromatogram of solutions of standard sample， crude heparin and its purified product

由图3可知，多硫酸软骨素和肝素钠出峰时间分别为13.878 min和17.235 min，分离度较好。本实验用的粗品肝素钠采用酶法生产，原料液和纯化液中均未发现有OSCS。纯化液峰面积与肝素钠标样峰面积的比值为15.69，而原料液与肝素钠标样峰面积的比值为9.98，20 mg/mL纯化液中肝素钠含量为20 mg/mL，为原料肝素钠含量的1.57倍，纯度提高了57.21%，杂质被分离。

2.3 超声波辅助酯化的实验结果

2.3.1 超声功率对肝素苄基酯的影响 将反应液放入超声波清洗器中，温度为35～40 ℃，超声酯化反应3 h。超声波功率对肝素苄基酯酯化率的影响见图4。

图4 超声功率对酯化率的影响Fig.4 The effect of ultrasonic power on esterification level

由图4可知，随超声功率增大，酯化率增大，超声功率在400 W时，酯化率较高，以后增加趋于平缓。超声波在通过液体时产生空化气泡，气泡在超声波传播时，振荡破裂，造成热力效应、机械效应和化学效应[16]，加速了物质分子间的碰撞，从而加快反应，缩短反应时间，提高酯化率[17]。当超声波功率由低到高时，产生的空化作用由弱变强，引起酯化率显著增加。当超声功率达到500 W的时候，酯化率的增加速度有所降低，以防功率过高，引起肝素苄基酯长链分子的降解，所以选择最佳超声功率为400 W。

由图5可知，随着反应时间的增加，酯化率逐渐提高，5 h以后其提高速率有所减缓。在超声过程中，超声波振荡产生的强烈空穴效应、自由基效应[18]、热力学和非热力学等多重效应的作用，增强了分子间的作用力，同时其自由基效应在空穴气泡崩馈时，其气泡内部气相在高温高压条件下裂解成 —H和 —OH，以及在空穴气泡与周边液体界面上由于极端的温差导致能量集中，使溶液热解产生自由基的现象，加速了酯化作用。酯化作用不可能无限的进行，当溶液达到饱和时，酯化反应达到平衡，酯化率将不再升高。在超声4 h时，其酯化率已达到4.72%，相当于在水浴中反应25 h的酯化率4.65%。超声5～6 h，酯化率增加趋于减缓，所以确定最佳超声时间为5.5 h。

图5 时间对酯化率的影响Fig.5 The effect of time on esterification rate

2.4 响应面优化实验

在肝素苄基酯的反应中，金飞等人已研究证明当温度为35～40 ℃时，酯化率较好。同时二氯甲烷的沸点为40 ℃，如果温度过高，也会影响肝素季铵盐的活性，影响低分子肝素钠的效价，所以选择时间和功率，作为主要因素，采用Design-Expert8.0.06响应面设计中的Miscellaneous模型优化设计实验，以肝素苄基酯酯化率为响应值，因素与水平见表1，结果见表2。

表1 酯化率优化设计及编码水平Table 1 Optimum design factor and level of heparin benzyl esterfication

表2 Miscellaneous实验设计与结果Table 2 The Miscellaneous design and its results

2.4.1 模型的建立及其显著性分析 利用Design-Expert8.0.0.6软件对上表数据进行多元回归拟合，得到响应值(Y)对编码自变量的二次多项回归方程是：Y=5.55+0.17A+0.50B+0.10AB-0.33A2-0.36B2。对该模型进行回归方差分析和显著性检验，结果见表3。

表3 响应面方差分析Table 3 The response surface analysis of variance

由表3可知，模型F值为 12.105 3，概率P=0.002 5<0.05，模型显著；模型的失拟项p=0.636 5>0.05，表明模型能够解释99.80%的实验结果，模型的变异系数CV%=1.59，说明模型的精密度好。同时，方程的失拟项F值为0.623 2，概率P>0.05，失拟项不显著，说明回归方程在整个回归区域的拟合情况良好，可用该回归模型代替实验真实点对实验结果进行分析。

由表3可知，对响应值作用极显著的是B，作用显著的是A2、B2，说明响应值与因素之间并不是简单的线性关系；时间对酯化率的影响非常明显。

2.4.2 响应面曲线图 采用Design-Expert8.0.0.6软件绘制响应面曲线图，结果见图6。

图6 超声功率和时间对酯化率的响应面图Fig.6 A response surface plot of ultrasonic power and reaction time on esterification rate

由图6可知，随着时间和功率的增加，酯化率逐渐增加，功率400～500 W时，酯化率随着时间的增加，达到了最佳值；当响应值达到一定程度后，会逐渐降低。

2.4.3 反应条件的优化及模型验证 模型给出的最优预测值为超声功率400 W，反应5.5 h，温度35～40 ℃时，理论酯化率为5.55%。在上面的条件下做3个平行样，实际测得值为5.35%，与预测值相对偏差为3.60%，与理论值基本吻合。说明采用响应面法优化得到的酯化条件准确可靠，具有实用价值。

3 结论

(1)利用甲醇纯化肝素钠原料，纯化后肝素钠含量为纯化前的1.57倍；利用弱阴离子高效液相法检测，测得样品中不含多硫酸软骨素。

(2)超声制备肝素苄基酯的优化条件为：温度35～40 ℃，超声功率400 W，反应时间5.5 h，酯化率为5.35%。比常规工艺节省了20 h左右，且酯化率提高15.05%。