酪酸梭菌双岐杆菌二联活菌对早产小鼠CD4+ T细胞CD28和PD1表达的影响及意义

方 玢，秦道建，唐宗生,陶雨琦,郑雨微,张士发

(1.皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 a.儿科;b.输血科，安徽 芜湖 241001；2.安徽省立医院 儿科，安徽 合肥 230000)

世界卫生组织将早产儿定义为在妊娠37周或259天内出生的新生儿[1]。早产儿免疫功能低下导致严重的并发症，适应性免疫应答可能是重要原因之一。T淋巴细胞介导的细胞免疫在适应性免疫应答中发挥关键作用，T淋巴细胞的活化需要CD28和PD1等共刺激分子的参与，CD28对T细胞的存活因子IL-2的产生和Bcl-xL的上调至关重要，PD1负向调控效应T细胞的增殖与活化[2]。益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，能够改善肠道的微生态平衡，并能刺激肠黏膜免疫组织，增强肠道免疫力[3]。然而，关于益生菌是否影响T细胞的活化及其影响机制的研究较少。本研究通过给予早产小鼠酪酸梭菌双岐杆菌二联活菌灌胃，动态观察CD4+T细胞表面CD28和PD1的表达情况，探讨酪酸梭菌双岐杆菌二联活菌对早产小鼠CD4+T细胞CD28和PD1表达的影响及意义。

1 材料与方法

1.1 药品和仪器 酪酸梭菌双岐杆菌二联活菌购于山东科兴生物制品公司；米非司酮由深圳市资福药业有限公司提供；Hamster Anti-mouse CD3e FITC、Rat Anti-Mouse CD4 PE-CYTM5、Rat Anti-Mouse CD8a PE-CYTM7(美国BD Pharminge公司)；Anti-Mouse CD279 PE、Anti-Mouse CD28 PE(美国e Bioscience公司)；小鼠红细胞裂解液(Biosharp公司)；高速低温离心机、各种规格移液器(美国Thermo Fisher公司)；Beckman Coulter FC500流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)；台式低速离心机(湘仪离心机器械厂)；XW-80A 旋涡混合仪(海门市其林贝尔仪器制造公司)。

1.2 动物 8周龄SPF级BALB/c健康成年小鼠(雌性18只，雄性9只)，体质量18～22 g(江苏省南京市青龙山动物饲养中心提供)，雌雄小鼠采用2∶1配对饲养。

1.3 早产及足月小鼠造模 用米非司酮(RU486)腹腔注射无菌孕鼠建立早产模型[4]。雌鼠检查到阴栓记为妊娠第1天，单笼饲养，随机选择部分孕鼠于孕第18天及第19天晨8点腹腔注射用蓖麻油溶解的米非司酮(剂量0.15 mg/kg,)，获得胎龄<20 d的新生早产小鼠。另外的孕鼠待其自然分娩，收集胎龄>20 d的新生足月小鼠。

1.4 分组及给药 随机将P1早产小鼠分为早产实验组(Ⅰ组)和早产对照组(Ⅱ组)，同日龄足月小鼠为足月对照组(Ⅲ组)，每组16只。Ⅰ组给予酪酸梭菌双岐杆菌二联活菌灌胃[5](灌胃体积为100 μL/10g)，同一时间，给予Ⅱ组与Ⅲ组等量生理盐水灌胃,均于灌胃后按窝返回母鼠身边饲养。

1.5 取血 各组分别在P14、P21随机选取小鼠8只，乙醚麻醉，眼球取血法取血>500 μL，EDTA-K2抗凝后，置于冰上备用。

1.6 CD28和PD1分子检测 取2只流式管分别标为①、②，向两管中各加入100 μL stain buffer、荧光标记的抗体CD3e-FITC、CD4-PEcy5、CD8-PEcy7各1 μL；再向①管中加入1 μL CD279-PE，②管加入1 μL CD28-PE;两管中各加入外周血100 μL，避光孵育20 min；两管分别加入鼠红细胞裂解液2 mL，裂解2 min，1500 rpm离心5 min，重复1次；两管加stain buffer各2 mL，1500 rpm离心5 min，倒去上清液，重复1次；两管加stain buffer各700 μL后上机检测；采用 Flow Jo VX 软件进行CD28、PD1的表达量分析。

1.7 统计方法 采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析，用Holm-Sidak检验进行多组间两两比较，两组间、组内比较用独立样本t检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 早产对小鼠CD4+T细胞表面CD28表达水平的影响 详见图1。图1A为新生小鼠CD4+T细胞表面CD28表达图。在P14，Ⅱ组小鼠CD4+T细胞表面CD28的表达与Ⅲ组比较差异无统计学意义(P=0.073)；而在P21，Ⅱ组CD28的表达量高于Ⅲ组(P=0.040)，见图1B。并且Ⅱ组CD28的表达量随日龄的增加而升高(P=0.024)；而Ⅲ组CD28的表达随着时间的延长未见明显变化(P=0.108)，见图1C。

2.2 早产对小鼠CD4+T细胞表面PD1表达水平的影响 详见图2。图2A为新生小鼠CD4+T细胞表面PD1表达图。在P14，Ⅱ组小鼠CD4+T细胞表面PD1的表达与Ⅲ组比较差异无统计学意义(P=0.225)；而在P21，早产对照组PD1的表达量高于Ⅲ组(P=0.000)，见图2B。并且Ⅱ组PD1的表达量随日龄的增加升高(P=0.000)；而Ⅲ组PD1的表达随着时间的延长未见明显变化(P=0.393)，见图2C。

2.3 酪酸梭菌双岐杆菌二联活菌对早产小鼠CD4+T细胞表面CD28表达的影响 详见图3。在P14和P21，Ⅰ组 CD4+T细胞表面CD28的表达均高于Ⅱ组(t=6.784,t=4.577,P均=0.000)和Ⅲ组(t=4.315,t=6.746,P均=0.000)，见图3A。而Ⅰ组CD28的表达在P14与P21未见明显差异(t=1.567,P=0.139),见图3B。

图1 早产与足月小鼠CD4+T细胞表面CD28表达的比较

图2 早产与足月小鼠CD4+T细胞表面PD1表达的比较

图3 酪酸梭菌双岐杆菌二联活菌对早产小鼠CD28表达的影响

2.4 酪酸梭菌双岐杆菌二联活菌对早产小鼠CD4+T细胞表面PD1表达的影响 详见图4。在P14和P21，Ⅰ组CD4+T细胞表面PD1的表达均高于Ⅱ组(t=25.06,t=2.879,P均<0.05)和Ⅲ组(t=24.06,t=8.611,P均=0.000)，见图4A。而Ⅰ组PD1的表达量随日龄增加明显降低(t=9.314,P=0.000),见图4B。

3 讨论

酪酸梭菌双岐杆菌二联活菌是酪酸梭状芽孢杆菌和婴儿型双歧杆菌混合制剂，可以促进肠道有益菌的生长，维持肠道菌群的平衡，对肠道内病原菌的抑制有显著作用[6]。Ling等[7]发现酪酸梭菌双歧杆菌混合物可能是治疗抗生素相关性腹泻(AAD)的一种简单有效的方法。有临床研究表明[8]，肺炎住院儿童在应用抗生素的基础上加用酪酸梭菌双岐杆菌二联活菌，可有效降低其发生AAD的风险，未发现其不良反应。

图4 酪酸梭菌双岐杆菌二联活菌对早产小鼠PD1表达的影响

PD1信号通过多种机制抑制T细胞的免疫功能，如抑制自身反应性初始T细胞向效应T细胞转化、诱导效应 T细胞向Tregs转化以及通过激活Tregs或 DC等来抑制效应T细胞[9]，通过干扰CD28介导的PI3K激活而抑制Akt磷酸化，从而阻断T细胞的增殖与活化[2]。有研究表明[10]，用抗CD80 mAb和抗4-1BBL mAb阻断CD28/B7-1协同刺激途径，均可明显抑制T细胞增殖，且阻断CD80对于CD4+T细胞的增殖抑制作用强于阻断4-1BBL 产生的抑制作用，即CD28/B7-1对CD4+T细胞的增殖具有重要作用。Hui E等[11]发现共受体 CD28是 PD1受体 Shp2磷酸酶去磷酸化的首选靶点，并且在完整的细胞系统中，PD-L1激活 PD1后，CD28而不是 TCR 优先被去磷酸化，提示PD1主要通过阻断CD 28信号通路而抑制T细胞功能。

正常足月儿在妊娠的最后3个月高度依赖经胎盘传递的母亲的 IgG活化T细胞来控制病原体，然而，早产儿经胎盘传递的母体抗体显著减少，先天免疫不成熟，因此发育过程会引起早产儿的先天免疫反应的差异，使他们面临严重感染的风险[12]。Bo等[13]人研究发现，相对于足月儿，早产儿生后CD4+、CD8+及CD4+/CD8+有追赶趋势。本研究表明，在P14，Ⅱ组CD28的表达与Ⅲ组比较差异无统计学意义(P>0.05)，但在P21，Ⅱ组高于Ⅲ组(P<0.05)，随着天数的延长，Ⅲ组CD28的表达无明显变化(P>0.05)，而Ⅱ组有上升趋势(P<0.05)，即Bo等人发现的追赶趋势。同时，本研究还发现，在P21，PD1的表达Ⅱ组高于Ⅲ组(P<0.05)，并且随着日龄增加，Ⅱ组PD1的表达逐渐增多(P<0.05)，而Ⅲ组未见明显变化(P>0.05)，可能是机体为维持免疫平衡而进行的自身调节，表明早产使小鼠外周血CD4+T细胞表面CD28和PD1的表达出现异常。李国军等[14]研究发现，使用益生菌治疗后的早产儿CD4+、CD4+/CD8+等T淋巴细胞亚群均高于对照组，表明益生菌可能通过促进T细胞的活化与增值，提高早产儿的免疫功能。本研究与李国军等[14]取得相似的研究成果。在P14和P21，Ⅰ组小鼠外周血CD4+T细胞表面CD28表达水平均高于Ⅱ组(P<0.05)和Ⅲ组(P<0.05)，表明给予早产小鼠酪酸梭菌双岐杆菌二联活菌明显加快了“追赶”的进度并且超过了同时间段足月小鼠的水平，说明酪酸梭菌双岐杆菌二联活菌能促进早产小鼠产生更多活化的CD4+T细胞，使其具有更高的免疫功能。本研究还发现，在P14和P21，Ⅰ组小鼠外周血CD4+T细胞表面PD1表达水平也均高于Ⅱ组(P<0.05)和Ⅲ组(P<0.05)，但是随着日龄增加，Ⅰ组PD1的表达明显降低(P<0.05)。可能是早产小鼠免疫功能异常，但是给予酪酸梭菌双岐杆菌二联活菌治疗后，促进T细胞增殖与活化的CD28分子表达增多，抑制性信号分子PD1的表达在短时间内上调后因酪酸梭菌双岐杆菌二联活菌的干预继而开始下调。提示酪酸梭菌双岐杆菌二联活菌可能通过介导CD4+T细胞表面CD28/PD1表达的上升或下降，调节T细胞的成熟与活化，从而改善早产小鼠的免疫功能。

需要指出的是，本文也存在一些不足：①各组的样本数量不够多；② 因幼鼠出生后体积小，取血量不足，未能有效记录早期数据；③人与小鼠还是存在差异，后续研究需扩大样本量以及进行相应的临床试验，使研究结果更具权威性。

综上所述，早产导致小鼠CD4+T细胞表面CD28和PD1的表达出现异常，给予早产小鼠酪酸梭菌双岐杆菌二联活菌，可调节CD4+T细胞表面CD28和PD1的表达，促进早产小鼠免疫功能的发育和成熟。