精浆AMH水平对非梗阻性无精症的临床预测价值

段丽 陈艺 杨帆

[摘要] 目的 探討抗缪勒管激素（AMH）水平对非梗阻性无精子症（NOA）的临床预测价值。 方法 釆用酶联免疫法和电化学发光免疫分析法检测NOA患者精浆AMH、血清促卵泡激素（FSH）以及睾酮（T）的浓度;B超检测其睾丸体积;通过睾丸显微取精术（M-TESE）检获精子;同时设置对照组，并进行统计学分析。 结果 NOA组的AMH浓度分别低于OA组[（19.53±9.13）pmol/L，（52.34±15.13）pmol/L，P<0.05]及NF组[（158.53±37.45）pmol/L，P<0.05];NOA组的FSH浓度分别高于OA组[（18.36±8.95）U/L，（5.51±3.32）U/L，P<0.05]及NF组[（6.12±3.02）U/L，P<0.05];NOA患者的睾酮浓度[（15.32±5.43）nmol/L]分别与OA组[（15.63±6.23）nmol/L]、NF组[（15.81±5.73）nmol/L]比较无显著性差异（P>0.05，P>0.05）;NOA组左右睾丸体积TV[（9.58±3.83）mL，（7.46±3.57）mL]分别与OA组[（16.97±2.56）mL，（15.32±3.63）mL]、NF组[（16.23±3.53）mL，（16.84±2.83）mL]存在显著性差异（P<0.05，P<0.05）。NOA组有10人检获精子，OA组19人检获精子（P<0.05）。Logistic回归分析检验发现AMH预测NOA 患者睾丸内是否存在精子的拟合优度最佳（Wald χ2=26.198，P<0.01）;ROC曲线图显示精浆AMH的AUC值最大;精浆AMH的阳性似然比为7.36[81.82%/（1-88.89%）]，阴性似然比为0.20[（1-81.82%）/88.89%]。 结论 精浆AMH 浓度对于预测NOA 患者M-TESE成功与否具有重要的意义。

[关键词] 非梗阻性无精症;抗缪勒管激素;睾丸显微取精术;精子检获

[中图分类号] R446.6          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）31-0001-04

Clinical predictive value of seminal plasma AMH level for non-obstructive azoospermia

DUAN Li1， 2   CHEN Yi2   YANG Fan2   DU Dan2   WANG Kegeng1   LU Siyu3   SHEN Wentao4   LIU Yan1

1.Institute of Pathogenic Biology， Hengyang Medical College， Nanhua University， Hengyang   421001， China; 2.Chenzhou First People's Hospital， Chenzhou   423000， China; 3.School of Nursing， Nanhua University， Hengyang   421001， China; 4.Huilongshan Town Health Center of Tuanfeng County in Huibei Province， Tuanfeng   438800， China

[Abstract] Objective To evaluate the clinical predictive value of anti-Mullerian hormone（AMH） level for non-obstructive azoospermia（NOA）. Methods Enzyme-linked immunosorbent assay and electrochemiluminescence immunoassay were used to detect the concentration of seminal plasma AMH， serum follicle stimulating hormone （FSH） and testosterone （T） in NOA patients. B-ultrasound was used to test testicular volume. And Sperm was acquired by M-TESE. The control group was set up at the same time and statistical analysis was performed. Results The AMH concentration （19.53±9.13） pmol/L in the NOA group was lower than that in the OA group （52.34±15.13） pmol/L and that in the NF group （158.53±37.45） pmol/L， P<0.05. The FSH concentration （18.36±8.95） U/L in the NOA group was higher than that in the OA group （5.51±3.32） U/L and that in the NF group （6.12±3.02） U/L， P<0.05. The testosterone concentration in NOA patients （15.32±5.43） nmol/L was not significantly different from that of OA group （15.63±6.23）nmol/L and NF group （15.81±5.73）nmol/L， P>0.05. The left and right testicular volume TV in the NOA group was（9.58±3.83）mL and（7.46±3.57）mL， which was significantly different from that in the OA group （16.97±2.56）mL and （15.32±3.63） mL， and that in the NF group（16.23±3.53）mL and（16.84±2.83）mL， P<0.05. Sperm was detected in 10 patients in the NOA group and 19 in the OA group （P<0.05）. Logistic regression analysis showed that AMH predicted the best fit of sperm in the testis of NOA patients （Wald χ2=26.198， P<0.01）.ROC curve showed the AUC value of seminal plasma AMH was the highest. The positive likelihood ratio of the seminal plasma AMH was 7.36（81.82%/（1-88.89%）），and the negative likelihood ratio was 0.20 （1-81.82%）/88.89%）. Conclusion The concentration of seminal plasma AMH is important for predicting whether the success of M-TESE in patients with NOA or not.

[Key words] Non-obstructive azoospermia; Anti-Mullerian hormone; Microdissection testicular sperm extraction; Sperm acquisition

无精子症（Azoospermia）是男性不育的主要原因，是指连续3次精液及射精后的尿液在3000 g以上的离心标本离心15 min后，沉渣镜检未发现精子[1]。无精子症分非梗阻性无精子症（non-obstructive azoospermia，NOA）和梗阻性无精子症（obstructive azoospermia，OA）两大类，可通过激素水平和睾丸大小进行鉴别[2]。随着现代医学的发展，部分NOA患者可通过睾丸显微取精术（Micro-testicular sperm extraction，M-TESE）获取精子进行试管婴儿生育[3]，但M-TESE创伤大、并发症多，因此研究无创预测睾丸穿刺取精获得精子的指标具有重要意义。本研究选择某院20例NOA患者的临床资料，分析生殖激素水平与睾丸大小等参数对M-TESE结果的预测价值，以期为NOA患者是否需要接受外科手术治疗提供临床依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

依据世界卫生组织标准，选取2015年1月～2018年12月期间在某院生殖中心不育门诊就诊的不育患者。在获得NOA患者知情同意后，收集其精浆和血清作为研究样本，同时设置梗阻性无精症OA患者和正常生育（normal fertility，NF）者为对照组。每组选取20例。NOA组20例，为各种睾丸生精功能不足而核型正常的NOA患者，包括原因不明的NOA患者15例，睾丸接受放化疗者1例，隐睾症者1例，精索静脉曲张者3例，平均年龄（33.82±5.69）岁。OA组共20例，包括输精管切除术者5例、输精管梗阻者10例和射精管梗阻者5例，平均年龄（33.82±5.69）岁。三组受试对象的年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2 仪器与试剂

ELx-800型酶标仪（美国宝特，BIO-TEK），ELx-50型洗板机（BIO-TEK）均由上海新波生物技术有限公司提供;全自动电化学发光免疫分析仪（Roche HITACHI cobas 6000）由德国罗氏诊断产品（Roche Diagnostics GmbH）上海有限公司提供;体视镜（SMZ800）为日本Nikon公司产品，倒置显微镜（CKX53）为日本Olympus公司产品。B超（Logiq E9）为美国GE（General Electric Company）产品。抗缪勒管激素（anti-mullerian hormone，AMH）、促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，FSH）检测试剂盒和睾酮（testosterone，T）检测试剂盒等均购于罗氏上海有限公司。

1.3 检测方法

1.3.1 血清促卵泡激素及睾酮的检测  待检者空腹，常规于前臂浅静脉处抽取5 mL血样，分离血清后，2 h内检测其血清促卵泡激素及睾酮的浓度。FSH浓度检测：选择罗氏Roche HITACHI型电化学发光全自动免疫分析系统及配套FSH浓度检测试剂盒，FSH的最低检测限为0.10 IU/L。根据试剂盒说明，将离心处理后的血液样本置于标本槽内，采用电化学发光免疫分析法（Electrochemiluminescent immunoassay，ECLIA）双份测定FSH水平。睾酮T浓度检测：选择配套睾酮T浓度检测试剂盒，T的最低检测限为0.14 nmol/L。根据试剂盒说明，将离心处理后的血液样本置于标本槽内，ECLIA双份测定T水平。

1.3.2 精漿中所含抗缪勒管激素浓度的检测  待检者均在釆集精液前一周停止性生活，手淫采集精液[4]，置于无菌容器中37℃水浴30 min液化;1 h内取3～5 mL液化精液样本，离心5 min后置于-80 ℃贮藏备用，保存期限1个月。AMH浓度检测：选择Roche公司提供的酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）双份重复测定，AMH的最低检测限为3.2 pmol/L。根据试剂盒的说明进行。将试剂盒置室温平衡30 min后使用，冻存样本复融后应经过充分的混匀。样品孔先加入样品稀释液40 μL，然后再加待测样品10 μL（样品最终稀释5倍）。设置对照组，轻轻振荡混匀后封板膜封板，37℃温育30 min;每孔加酶标试剂50 μL，轻轻振荡混匀后封板膜封板，37℃温育30 min后，洗板5遍，扣干;每孔加入显色剂A、B液各50 μL，轻振荡混匀，37 ℃避光显色15 min;每孔加终止液50 μL，轻振荡混匀;设定酶标仪波长于450 nm处，空白孔调零后，15 min内测定各孔OD值。以标准物的浓度和OD值分别为横坐标和纵坐标，绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数即为样品的实际浓度。

1.3.3 B超检测睾丸体积  运用B超仪高频探头9～15 Mz进行测量，具体数据以公式为准，睾丸的体积=睾丸的前后直径×左右直径×上下直径×0.71。

1.3.4 睾丸显微取精术  取较大侧睾丸，常规消毒皮肤并麻醉后，通过显微镜放大足够倍数（通常20倍左右）后，切开至睾丸白膜，避开白膜下血管，睾丸中部切开白膜0.5～1.0 cm，用外科剪刀切开并分离，获取含有饱满不透明的曲细精管睾丸组织25～50 mg，将睾丸组织送检。剪取外观饱满、乳白色半透明或不透明、相对粗大并有张力的生精小管，体视镜下取出后置于Falcon 3001培养皿Gemete培养液（Irvine scientific，santa anna，CA，美国）中立即用注射针头撕裂研磨，倒置显微镜下查找精子。

1.4 参数计算方法

灵敏度=真阳性人数/（真阳性人数+假阴性人数）×100%，特异度=真阴性人数/（真阴性人数+假阳性人数）×100%，阳性预测值=真阳性例数/（真阳性例数+假阳性例数）×100%，阴性预测值=真阴性例数/（真阴性例数+假阴性例数）×100%，阳性似然比=灵敏度/（1-特异度）;阴性似然比=（1-灵敏度）/特异度。

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件分别进行组间统计学分析，计数资料用率（%）表示，采用χ2检验;计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析后采用Student-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。通过Logistic回归分析，筛选出与患者行睾丸穿刺活检发现精子相关程度较高的指标。应用Microsoft Excel 2013绘制受试者工作特征曲线（receiver operating curve，ROC）图[5]，根据ROC曲线下的面积（area under the curve，AUC）来判断监测方法的优劣[6]。

2 结果

2.1 三组生殖激素水平、睾丸体积及有精子人数比较

NOA组的FSH浓度[（18.36±8.95）U/L]分别高于OA组[（5.51±3.32）U/L]及NF组[（6.12±3.02）U/L]，差异有统计学意义（P<0.05）。NOA组的睾酮浓度[（15.32±5.43）nmol/L]分别与OA组[（15.63±6.23）nmol/L]、NF组[（15.81±5.73）nmol/L]比较，差异无统计学意义（P>0.05）。NOA组的AMH檢测值[（19.53±9.13）pmol/L]分别低于OA组[（52.34±15.13）pmol/L]及NF组[（158.53±37.45）pmol/L]，差异有统计学意义（P<0.05）。B超检测睾丸体积（TV），NOA组左右两侧TV[（9.58±3.83）mL，（7.46±3.57）mL]分别小于OA组[（16.97±2.56）mL和（15.32±3.63）mL]及NF组[（16.23±3.53）mL和（16.84±2.83）mL]，差异有统计学意义（P<0.05）。NOA组患者检获精子人数（10/20）低于OA组（19/20），差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 数据分析

2.2.1 各指标拟合度分析  采用Logistic回归分析发现：AMH对预测NOA患者睾丸内是否存在精子的拟合优度最佳（Wald χ2=26.198，P<0.05），优势比（Odds Ratio，OR）最高，为8.384;其次为FSH（Wald χ2=21.492，P<0.05），再者为睾丸体积（Wald χ2=20.934，P<0.05），T参数在回归分析模型中拟合度不佳，OR值最低。见表2。

2.2.2 各指标的ROC曲线  以睾丸穿刺结果为状态变量，分别以生殖激素水平和睾丸体积及相关参数为检验变量，利用Microsoft Excel 2013绘制ROC曲线图（图1），由图1可见，精浆AMH的AUC值最大（0.87）。

2.3 各项指标预测睾丸组织活检有无精子的价值

以睾丸穿刺结果为“金标准”，20例NOA患者中有11例可在精浆中检出AMH，其中9例在睾丸组织活检中发现精子，阈值（Cut-off值）≥10.58 pmol/L;精浆检测不出AMH的患者有9例，其中8例组织活检无精子。精浆AMH的灵敏度是81.82%[9/（9+2）]，特异度是88.89%[8/（8+1）];阳性预测值为90.00%[9/（9+1）]，阴性预测值为80.00%[8/（8+2）];阳性似然比为7.36[81.82%/（1-88.89%）]，阴性似然比为0.20]（1-81.82%）/88.89%]。见表3。

3 讨论

随着人类辅助生殖技术的产生和不断进步发展，临床上出现了单精子卵胞浆显微注射术（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI），使用显微操作技术将精子注射到卵细胞胞浆内，受精后体外培养到早期胚胎，再放回母体子宫内发育着床;因此即便是NOA患者，也可通过利用ICSI进行生育[7]。在临床实践中发现，有45%左右的NOA患者，经过多次重复的睾丸显微取精术（M-TESE），会促使睾丸产生精子量提升，从而保证ICSI的顺利进行[8]。但M-TESE创伤大、并发症多，同时要配合女性的取卵术。多次重复的外科手术诊断和治疗，给患者夫妻的经济和心理都带来巨大的影响[9，10]。因此，研究无创预测M-TESE获得精子的指标具有重要意义。

血清FSH的浓度在长时间内一直被认为是有效的无精子症标志物，如果FSH水平上升，表明精子生成障碍[11，12];然而随着M-TESE使用率越来越广泛，部分无精子症患者也可通过活检获得精子，因此血清FSH不再被认为是一个明确的无精子症的标志物[13]。

精浆AMH来源于睾丸，当人进入青春期以后，AMH会从睾丸支持细胞的最顶端逐步向周围曲细精管腔内分泌，这种现象可能与青春期睾丸开始发挥作用有关：在生精上皮特定的周期阶段，精浆内AMH的分泌增强，和精子的生成有一定的关系;即便在输精管切除术后，仍然可以在精浆中检测到AMH[14]。因此，患者精浆AMH可以理解为患者生殖系统细胞缺乏症的标志物，用于判断患者是否完全缺乏精子，AMH检测是针对NOA患者的一种无创性的检测。

在本研究中，发现NOA患者精浆AMH浓度、血清FSH浓度及睾丸大小较OA患者及正常人均有显著性差异，说明这三者与患者生精功能障碍有直接的关系，与精子的成功生成有一定的关联。Logistic回归分析发现AMH对预测NOA患者睾丸内是否存在精子的拟合优度最佳，ROC曲线图显示精浆AMH的AUC值最大，由此可见，较之血清FSH浓度及睾丸体积，精浆AMH浓度与睾丸显微取精术的成功率有更大的关联性。

阳性似然比、阴性似然比结合了敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值的优点，既可以根据患者有无某项报警症状来做预测，同时又不受被检人群中病变发生率的影响，可用于多种临床环境中，因此是一个相对独立的、更具临床意义的诊断性试验效果的评估指标[15]。当阳性似然比>10或阴性似然比<0.1时，诊断或排除某种疾病的可能性就显著增加。在本项研究中，AMH浓度的似然比更加接近理想值。

由此可见，与血清FSH、T浓度和TV等经典的精子生成预测指标相比，NOA患者的精浆AMH浓度，预测M-TESE成功与否的诊断效率更高。精浆AMH浓度作为一种非侵入性持久的精子发生过少的标志物，可在ICSI术前预示睾丸精子数量恢复成功的可能性，在临床实践中具有一定的应用价值。

[参考文献]

[1] Vij SC，Sabanegh E JR，Agarwal A.Biological therapy for non-obstructive azoospermia[J].Expert Opin Biol Ther，2018，18（1）：19-23.

[2] Huang IS，Huang WJ，Lin AT. Distinguishing non-obstructive azoospermia from obstructive azoospermia in Taiwanese patients by hormone profile and testis size[J].J Chin Med Assoc，2018，81（6）：531-535.

[3] Ran R，Kohn TP，Ramasamy R. Innovations in surgical management of nonobstructive azoospermia[J].Indian J Urol，2016，32（1）：15-20.

[4] 劉伯龙，王娟花，唐正，等.解脲支原体感染对不育男性精液质量及生育能力的影响[J].中南医学科学杂志，2016，44（4）：421-424.

[5] 杨浏，黎增文.用Excel制作ROC曲线[J].现代检验医学杂志，2005，20（4）：81-82.

[6] Bandos AI，Guo B，Gur D.Jackknife variance of the partial area under the empirical receiver operating characteristic curve[J].Stat Methods Med Res，2017，26（2）：528-541.

[7] Rosenwaks Z，Pereira N.The pioneering of intracytoplasmic sperm injection：Historical perspectives[J]. Reproduction，2017，154（6）：F71-F77.

[8] Hibi H，Sumitomo M，Fukunaga N，et al. Superior clinical pregnancy rates after microsurgical epididymal sperm aspiration[J]. Reprod Med Biol，2017，17（1）：59-63.

[9] 唐金鑫，宋乐彬，秦超.睾丸显微取精术在非梗阻性无精子症中的应用[J].中华男科学杂志，2016，22（8）：730-734.

[10] 张靖，梁晓燕，刘贵华.睾丸显微取精术的应用与提高[J].临床外科杂志，2018，26（2）：88-90.

[11] 毛金观，金玉霞.无精子症、严重少精子症睾丸容积与血FSH和AZF基因微缺失的相关性分析[J].中国优生与遗传杂志，2017，25（5）：26-27.

[12] 李芃，许蓬，宋世威，等.FSH治疗特发性非梗阻性无精子症的疗效分析（附15例报告）[J].生殖医学杂志，2019， 28（2）：192-194.

[13] Hussein A，Ozgok Y，Ross L，et al. Optimization of spermatogenesis-regulating hormones in patients with non-obstructive azoospermia and its impact on sperm retrieval：A multicentre study[J].BJU Int，2013，111（3）：110-114.

[14] Alfano M，Ventimiglia E，Locatelli I，et al.Anti-mullerian hormone-to-testosterone ratio is predictive of positive sperm retrieval in men with idiopathic non-obstructive azoospermia[J]. Sci Rep，2017，7（1）：17638.

[15] Egeland T，Slooten K. The likelihood ratio as a random variable for linked markers in kinship analysis[J]. Int J Legal Med，2016，130（6）：1445-1456.

（收稿日期：2019-07-12）