2018年蜜蜂病毒学研究进展

郑火青，邓 洁

（浙江大学动物科学学院，浙江 杭州 310058）

随着对蜜蜂病毒病了解的逐步深入，蜜蜂病毒学已经成为蜜蜂学研究中的一个重要分支领域。本文对2018年度国内外在蜜蜂病毒学研究上取得的进展进行梳理，以期为蜜蜂病毒学研究和蜜蜂病毒病的防控提供一些参考。

1 病毒流行病学

关于蜜蜂病毒病最基础的问题即是这些病毒在时间、空间和物种上的出现规律。因此，关于病毒的检测和分析是蜜蜂病毒学研究中经久不衰的主题。

Shum k ova等[1]检测了保加利亚不同地区8个蜂场50个蜂群250只蜜蜂的6种常见病毒的感染情况，并做了进化树分析，6种病毒分别为：蜜蜂急性麻痹病毒（Acute bee paralysis virus,ABPV）、黑蜂王台病毒（Blac k queen cell virus,BQCV）、慢性蜜蜂麻痹病毒 （Chronic bee paralysis virus,CBPV）、残翅病毒（Deformed win g virus,DWV）、克什米尔蜜蜂病毒（Kashm ir bee virus,KBV） 和囊状幼虫病毒（Sacbrood virus,SBV）。结果表明，除CBPV和KBV之外，其他4种病毒都有检出，检出率从高到低依次为DWV、SBV、ABPV和BQCV。值得注意的是，保加利亚蜜蜂病毒感染率很低，即使是作为检出率最高的病毒，DWV的检出率也只有10.20%，而SBV和BQCV的检出率更是只有6.12%和1.5%。

Chanpanit k itchote等[2]检测了泰国清迈省的西方蜜蜂（Apismellifera）、野生东方蜜蜂（Apis cerana） 及西方蜜蜂群里的梅氏热厉螨（Tropilaelapsmercedesae）上的蜜蜂残翅病毒和急性蜜蜂麻痹病毒，首次在东方蜜蜂和梅氏热厉螨上检测到ABPV；进化树分析显示，ABPV的传播历史可能是从梅氏热厉螨传播到西方蜜蜂，再到东方蜜蜂；而DWV的传播历史则可能是从东方蜜蜂到西方蜜蜂，再到梅氏热厉螨。

食蚜蝇也是一类重要的授粉昆虫，访花种类和蜜蜂相似[3]。英国伦敦大学皇家霍洛威学院和剑桥大学两个团队合作，对英国最常见的4个食蚜蝇种的各20只个体检测6种蜜蜂病毒（ABPV,BQCV,DWV-A型,DWV-B型,SBPV和SBV），在E ristalis tena x和E ristalis arbustorum 2个食蚜蝇种的部分个体能检测到BQCV和SBV，在E.arbustorum部分个体还能检测到DWV-B型。E ristalis上的SBV和西方蜜蜂SBV序列相似度达到95%～99%，BQCV相似度为87%～100%，这种最高达到99%和100%的序列相似度说明这2种病毒在食蚜蝇和西方蜜蜂间可以无障碍传播。尽管该研究未能在食蚜蝇上检测到病毒的负义链，不能说明这些病毒可以在食蚜蝇体内复制，但食蚜蝇上SBV的滴度和西方蜜蜂上滴度相似，说明食蚜蝇很可能能成为SBV的宿主，这些结果至少说明食蚜蝇作为病毒传播载体的角色不容忽视[4]。

2 病毒与其他致病因子的协同作用

蜜蜂抗病毒能力会受到其他因素的影响，而且不同因素共存很可能产生协同效应。绝大多数蜂群都携带或多或少的病毒，但不表现临床症状，在特殊条件下，这些隐性感染的病毒可能爆发，导致蜂群崩溃[5]。因此，病毒与其他致病因子的协同作用是蜜蜂病毒学研究的另一热点。

2018年度有2项研究都聚焦于CBPV与杀虫剂的协同关系。Coulon等[6]研究了噻虫嗪的代谢和与CBPV的协同作用关系。健康蜜蜂按照 0.25 n g/蜂·天的剂量摄入噻虫嗪后，可较快地将噻虫嗪降解为噻虫胺，而且大部分会被排出体外。而在噻虫嗪和CBPV共侵染的实验中，高剂量的噻虫嗪（5 n g/蜂·天） 在实验第8～10 d时出现显著更高的死亡率，但却未引起CBPV滴度升高；而相对低剂量的噻虫嗪（2.5 n g/蜂·天） 未导致更高的死亡率，但却引起CBPV滴度显著升高。该研究显示，病原和杀虫剂在蜜蜂上的协同作用关系可能比较复杂：更高的杀虫剂剂量不一定会引起更高的病毒滴度，而可能会引起蜜蜂对病毒感染的耐受度降低。

Diao等[7]研究了吡虫啉与CBPV之间的协同关系。给感染低滴度水平的CBPV的蜜蜂接种不同剂量的吡虫啉后，在接种66 n g/蜂的剂量96 h后，CBPV的滴度显著上升。该研究表明，隐性感染CBPV的蜜蜂接触高剂量吡虫啉后，健康情况可能受到显著影响，也暗示，急性环境压力因子可以成为病毒复制的主要加速因子，从而导致病毒大量扩增，进而导致蜂群衰亡。

狄斯瓦螨（Varroa destructor）是影响西方蜜蜂健康最重要的生物因子，其与病毒的协同作用是导致全世界蜂群损失的主要原因之一[8]。近年来，在全世界各地出现的多个西方蜜蜂自然抗螨种群为彻底解决狄斯瓦螨的问题带来了希望，也为研究狄斯瓦螨与病毒的协同作用关系提供了另一研究视角。Thaduri等[9]分析了2009-2010年间采集的瑞典哥特兰岛抗螨蜂群的病毒组，并和附近的普通蜂群进行了比较，除BQCV、SBV和DWV外，还发现了Apis rhabdo virus-1（A R V-1） 和L a k e Sinaivirus(L SV)2种病毒，且这2种病毒在普通蜂群中的滴度高于抗螨蜂群。抗螨蜂群中BQCV、DWV、A R V-1和L SV的滴度在2009年秋至2010年春之间都呈上升趋势，SBV在前3个时间点都有检出，在最后一个时间点（2010年春）却未检出。该团队在之前的一项研究中表明SBV对成年蜂蛋白加工过程起到负面影响，从而在蜂群健康方面扮演重要角色。这两项研究的结果似乎将SBV对西方蜜蜂蜂群健康的影响提高到了一个新的认识高度，但这些结论有待验证。

3 影响越冬意蜂的病毒种类

陈功文等[10]通过比较分析3个蜂场共48群意大利蜜蜂越冬前与越冬后病毒感染情况，及其中1个蜂场8群蜜蜂越冬期间病毒感染情况的变化，探究了与越冬期蜜蜂健康紧密相关的病毒种类。对所取样本检测ABPV、BQCV、CBPV、DWV、I APV和SBV等6种病毒的感染情况，并对感染率较高的病毒进行基因组拷贝数定量。研究表明，DWV、BQCV和I APV在越冬意蜂群中感染率很高。与越冬后正常蜂群相比，濒临死亡的蜂群I APV病毒量基因组拷贝数极显著更高，拷贝数到了109左右；出现蜂群死亡的蜂场在越冬期间，蜂群DWV基因组拷贝数病毒量呈下降趋势，而I APV基因组拷贝数病毒量呈上升趋势。这些结果表明，I APV是影响越冬期意蜂健康的重要因素。如何降低I APV感染水平及提高蜜蜂抗I APV能力是减少蜜蜂越冬期损失需面对的重要问题。

4 囊状幼虫病的基础研究和防控

囊状幼虫病是中蜂的主要病害，同时对西方蜜蜂也有一定的影响[11]。2018年度蜜蜂病毒学研究领域影响力最大的成果当属发表于《美国科学院院刊》 （P N AS） 的关于SBV病毒粒子晶体结构解析的报道[12]。同时SBV作为已知影响中蜂健康最主要的病毒，也是国内学者最关注的病毒。

4.1 SBV病毒粒子晶体结构的解析

Procház k ová等[12]通过解析SBV病毒粒子的晶体结构，发现在SBV病毒粒子表面黏附有60拷贝数的微小衣壳蛋白，而在已报道的小核糖核酸病毒目相关病毒结构中均不存在类似的结构。从SBV基因组中的微小衣壳蛋白编码序列位置可以推测该微小衣壳蛋白是通过导入一个病毒蛋白酶的剪切位点在主要衣壳蛋白C端延伸段进化而来的。SBV病毒进入细胞过程中很可能遇到酸性p H，并由此分别诱发三重轴和五重轴中心直径大小7和12孔洞的形成。这与脊椎动物小核糖核酸病毒相反，因为当前普遍认为沿着二重二十面体对称轴的孔洞是基因组的释放位点。SBV病毒粒子无VP4亚基，而在很多相关的双顺反子病毒和小RN A病毒中VP4协助了基因组的释放。微小衣壳蛋白亚基在体外导致脂质体破碎，说明他们是VP4亚单位的功能相似物，使得病毒基因组能够穿过内体膜进入细胞质。

4.2 SBV病毒在台湾的流行

2016年春，台湾中部地区发生中蜂囊状幼虫病（以下简称中囊病）疫情。福建农林大学M ehmood[13]对台湾北部和中部地区2015-2016年的一些样本进行了检测，并进行了病毒系统发育分析。结果表明，从台湾地区分离得到的CSBV的基因序列与亚洲其他地区的CSBV的基因序列有高度相似性，说明该病毒是由外来引入的；在患病蜂群的个体中病毒流行率较低，在无症状的蜂群中未发现潜伏感染，说明CSBV在台湾的流行可能还处于初期，病毒尚未达到其最高的流行病潜力。

4.3 双顺反子中囊病病毒克隆的构建

M ehmood[13]还构建了一种模拟双顺反子病毒基因组结构的双顺反子中囊病病毒克隆。BQCV的基因间区IR E S在克隆后整合到中囊病病毒基因组3’-端非编码区之后，再接上E GF P基因与polyA区。转录后，将病毒RN A注射到蜜蜂幼虫体内，产生带蛋白壳的克隆病毒，接种后的幼虫表现出典型的中囊病症状和E GF P荧光。该研究首次成功构建了双顺反子中囊病病毒克隆，有助于更好地理解中囊病病毒的反向遗传学、致病机理以及传染机制，也为其他软腐病毒的研究提供了借鉴。

4.4 中囊病的防控

锦州医科大学张鹤[14]以纯化的中华蜜蜂囊状幼虫病毒（CSBV） 免疫BA L B/c小鼠，制备抗CSBV单克隆抗体，并对其效价、特异性和病毒中和能力进行检测。在此基础上，用制备的抗CSBV单克隆抗体作为诊断抗体，建立了一种检测CSBV的琼脂扩散检测方法。F ei等[15]通过酵母双杂交系统实验发现，蜜蜂G alectin蛋白可与中蜂囊状幼虫病毒VP3蛋白结合，参与了宿主与病原的作用过程。Sun等[16]将灭活中蜂囊状幼虫病毒接种母鸡，获得卵黄抗体，对感染CSBV蜂群的治愈率达到95%～100%。该研究表明卵黄抗体可用于中囊病的治疗和预防。中国农业科学院吴鹏杰[17]克隆和原核表达CSBV结构蛋白VP1，获得了大量VP1重组蛋白及最佳表达条件，为后期免疫组化检测CSBV病毒及构建CSBV的侵染性克隆提供了特异性抗体。同时，对响应CSBV的2个免疫相关基因S R P9和G ABA R AP进行了分子克隆、生物信息分析和原核表达研究，为从分子水平上预防和治疗CSBV病毒奠定基础。

5 结语

养蜂业是我国农业生产的重要组成部分，但近年来蜜蜂病害对养蜂业造成了较大影响。随着近年来蜜蜂病毒的广泛流行与传播，病毒病及病毒与狄斯瓦螨的协同作用对蜜蜂健康的影响越显突出。而病毒病的防控涉及消除病原、切断传播途径、减少与病毒协同作用的因素、提高蜜蜂抗病力等环节，是一个系统工程。当前，蜜蜂病毒学基础与应用研究都还很薄弱，有待进一步加强研究，并将研究结果与生产应用相结合，改善蜜蜂健康形势，为养蜂业健康发展保驾护航。