蜂毒化学成分的分离方法研究进展

陈艳娥，杜晓红，吴国泰，

（1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃 兰州 730000）

蜂毒是我国传统中药的宝贵资源，也是重要的蜂产品之一。中医认为蜂毒具有祛风、止痛、平喘的功效，现代药理活性主要是镇静和镇痛作用、扩张血管、降低血压、抗心律失常、改善冠状动脉供血和微循环的作用，还具有抗炎、抗菌、溶血、抗凝血、抗病毒以及防辐射等作用，可用于治疗风湿、类风湿性关节炎，神经炎，皮肤病等常见疾病。蜂毒主要含有蛋白质类、 肽类、生物胺类及其它未知成分，已被确定的功能物质有溶血肽、蜂毒明肽、镇静肽、磷酸脂酶A2、透明质酸酶、乙酸异戊酯及近60 种酶类。蜂毒活性成分的分析分离成为近几年的研究热点，主要方法和关键技术综述如下。

1 电泳法

李荣丽等[1]采用凝胶电泳和非凝胶技术对毒腺蜂毒和电取蜂毒的蛋白质组进行比较，对差异蛋白进行质谱分析、功能鉴定和生物信息学分析。结果发现，在毒腺蜂毒中存在30 种非冗余蛋白质，其中蜂毒毒素占50%，腺体保护蛋白和蜂毒毒素合成相关蛋白占50%；在电取蜂毒中存在14 种非冗余蛋白质，主要是蜂毒毒素成分，占93%；该研究在2 种蜂毒中发现了类磷脂酶A2，在毒腺蜂毒中发现了肽基辅氨酰顺反异构酶。本研究发现蜂毒明肽前蛋白原、镇静肽在毒腺蜂毒中的含量显著高于电取蜂毒，磷脂酶A2、毒液二肽基肽酶Ⅳ前体、毒液过敏性酸性磷酸酶和肥大细胞脱粒肽在电取蜂毒中含量较高，提示电击取毒可尽可能获得较多的蜂毒毒素。

2 色谱法

陈丹[2]采用制备HPLC 技术分离纯化了胡蜂毒的主要成分，并利用现代波谱技术和测序技术完成了各主要成分的结构表征，结果发现胡蜂毒中含有氨基酸、多肽蛋白类、多糖类、生物碱类和芳香仲胺类物质，不含有还原糖和苷类物质，对总多肽蛋白、游离氨基酸和多糖含量测定的研究结果表明，胡蜂毒含有丰富的蛋白多肽类物质以及游离氨基酸和多糖类成分，含量分别为56.28%、9.35%、15.95%。进一步研究得到6 个纯度均在98%以上的主要成分，占蜂毒含量约为86%。根据色谱峰保留时间依次命名为A、B、C、D、E、F，分子质量分别为111、176、1360、1478、33217、1381，其中A、B 属于胺类及生物碱类成分，C、D、F 为生物活性小肽，E 为生物活性蛋白家族亚型。

毛兵[3]采用高速逆流色谱建立一种新的分离蜂毒肽方法，可用于鉴定蜂毒肽的分子量及氨基酸一级结构，此方法成本低，样品无需前处理，所得产物不需后续处理，增加了一次分离量。对最佳分离条件（HSCCC 螺旋管转数为850 rmp、流动相流速为1 mL/min 及循环水浴温度为25℃） 下的分离产物进行分子量测定，分子量为2845，并根据一级结构的鉴定得知所得分离产物为蜂毒肽。

Zenon[4]通过建立新的液相色谱法对蜂毒成分进行分析，解决了磷酸脂酯A2 与蜂毒溶血肽不易分离的问题。

孟迂[5]综合运用多种色谱技术，从我国产意大利蜜蜂蜂毒中共分离得到10 个蜂毒毒素，通过进一步研究确定了这些蜂毒毒素的一级结构，其中3 个为新的蜂毒毒素，分别命名为melittin F1，secapin-1 和secapin-2。secapin-1、secapin-2 与已知多肽secapin的区别主要集中在第4 位、第16 位及第19 位氨基酸残基上。另有5 个蜂毒毒素通过测定LC-ESI-Q-TOF的二级质谱数据并结合数据库检索得到鉴定，分别命名为melittin F2、melittin F3、melittin F4、melittin 及melittin-G，其中melittin 为已知多肽，其它4 个多肽尚无天然存在的报道。进一步的研究表明，此种蜂毒中多为小分子量多肽，分子量范围主要在1000-3500 之间。能检测到的分子量大于5000 的多肽数量较少。

3 层析法

杨文超[6]使用QF-1 型超级蜜蜂电子自动取毒器获取意蜂蜂毒，经葡聚糖凝胶层析等分离纯化后，再经电泳对组分进行鉴定，证实该物质是蜂毒肽，是蜂毒主要组成成分及活性成分，是一种含有26 个氨基酸残基的阳离子抗菌肽。物质分子量为3000Da 左右，纯度为电泳级。

曾琳等[7]通过葡聚糖凝胶G-75 分子筛柱和肝素亲和柱两步分离纯化，成功从黑尾胡蜂蜂毒中纯化到了1 个磷脂酶活性组分，相对分子质量约为32000，命名为Vtp32。肽指纹图谱分析及N 端氨基酸序列比对结果显示Vtp32 与Vespa 属胡蜂磷脂酶A1(phospholipase A1，PLA1)具有高度的序列相似性。因Vtp32 可以特异性水解磷脂的sn-1 位，故Vtp32 为黑尾胡蜂PLA1。

余晓东等[8]用Sephadex G-25、Sephadex G-50、Celluose CM32 三步层析法从意蜂蜂毒中分离纯化得到Melittin 活性组分，其分子量为3000，由26 个氨基酸残基组成，富含中性氨基酸而不含Cys、Asp、Met、Tyr、Phe、His 六种氨基酸残基。

4 丙酮提取法

粗蜂毒多数采用层析分离的方法进行提纯，为缩短生产周期、节约成本，俞玉忠等[9]用丙酮提取法进行了试验。结果显示，用丙酮处理后的蜂毒不仅能把蜂蜜去除干净显示三条清晰的电泳色带，还使蜂毒的pH 值从4. 8 上升到5. 4，溶血活力从52 %提高到90 %，水分含量从8.2 %下降到2.4%，得率达到87.3%，这说明用丙酮法替代层析法是可行的。

5 多技术联用法

徐彭等[10]采用溶媒萃取、化学裂解和两次凝胶过滤柱层析，从蜂毒中得到电泳纯的蜂毒肽，其等电点为10.5，约占蜂毒干重的50%，是一种含有26 个氨基酸的小分子多肽。

孙敏[11]经Sephadex 凝胶、醇沉、反相高效液相色谱(RT-HPLC)优化分离纯化条件提纯蜜蜂蜂毒。通过Sephadex G-25 凝胶（以流速28 mL/h、上样量1.0 m L、上样浓度1.0 mg/mL） 获得两个组分P1、P2。收集P1 组分进行冷冻干燥，用3 倍体积无水乙醇沉淀，3000 r/min 离心5 min，沉淀即为蜂毒肽，测得蜂毒肽的相对分子量为2840Da 左右，提取率为96%，纯度为98%；上清经RT-HPLC，色谱柱Zorbax SB-C18(4.6×250μm)、进样量10μL、乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液为流动相，得到三种组分Q1、Q2、Q3，分别为肥大细胞脱粒肽(MCD 肽)、蜂毒明肽、镇静肽，相对分子量分别为2592 Da、2035 Da、2700 Da 左右，提取率分别为78.6%、89%、70%，其中MCD 肽和蜂毒明肽纯度分别为91.28%、90.16%。

朱伟等[12]利用利用凝胶过滤层析、肝素亲和柱层析、高效液相色谱等方法分离蜂毒多肽，得到的BVI-2H 是蜂毒多肽混合物，其主要成分的分子量为644.8 U。

黄永楷等[13]采用sephadex G-50F 柱层析及CM-sephadex C-50 离子交换柱梯度洗脱法，从蜂毒中分出Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ组分，其中Ⅱ峰量较多，生物活性较强，且有3 个蛋白吸收峰Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc。

张海花等[14]运用高分子电解质聚丙烯酸选择性沉淀蜂毒碱性多肽，通过Sephadex G -5 凝胶层析分离碱性多肽。研究表明，碱性多肽的等电点pI 为9.0，分子量约为2800 Da。

张文文等[15]开发的高效液相色谱串联质谱法对电击蜂毒中的组织胺、多巴胺、5- 羟色胺、肾上腺素和去甲肾上腺素进行测定。研究表明蜂毒样品中的五种生物胺在0.5 ～1000 ng／kg 范围内线性良好，R＞0.998，检测限和定量限范围分别为0.09～0.17ng／kg和0.30～0.59 ng／kg，在线性范围内的平均回收率范围为80.9 ～ll1.4%，日内RSD＜7.51%，日间RSD＜10.17%。此方法具有良好的精密度和重现性，并且简单快速、绿色环保。

Simona 等[16]采用高分辨率质谱图像新技术可对蜂毒进行有效分离还能测定主要成分的百分含量。在对蜂毒肽的分离、纯化与生物化学特性研究中，也发现一种新的肽，具有较弱的溶血性，且该物质的最大含量期出现在冬季的几个月份。

随着现代仪器分析技术的发展，更有效的分离，鉴定及分析蜂毒成分的方法将不断涌现，蜂毒在医药、临床及农业病虫害防治上的广泛应用将明显拓宽，蜂毒的活性、功能机理和药用开发等研究将进一步补充与完善。