菱形体蛋白的研究进展

万佳慧,王孝锦,姜世君，2,王秀丽，3,崔荣军

(1.牡丹江医学院生物化学与分子生物学教研室，黑龙江 牡丹江 157000；2.大庆医学高等专科学校检验教研室，黑龙江 大庆 163312；3.齐齐哈尔市第七医院检验科，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

菱形体蛋白(rhomboid-like protein，RHBDL)是生物界广泛存在的一种保守性膜内蛋白质，最早在果蝇中被发现，并以其基因突变的幼虫而命名，在果蝇发育和生长过程中具有重要作用。随后，在细菌和酵母中也阐明了这种蛋白质的作用。近年来，对于菱形体蛋白的认识主要集中在果蝇和顶复器门原虫中，为疫苗候选基因的研究提供了理论依据[1]。随着研究的深入，在哺乳动物中也已确定有多种菱形体蛋白，分布在主要的细胞器中，分别具有不同的生物酶活性。本综述介绍了菱形体蛋白对其底物的特异性结合、对底物的加工修饰、在信号转导过程中的作用及与人类疾病的关系。

1 菱形体蛋白的分类、分布和主要生物学功能

菱形体蛋白根据发现的先后和分子特点，可分为RHBDL1、RHBDL2、RHBDL3、RHBDL4及早老素相关菱形样蛋白(presenilinassociatiated rhomboid like protein，PARL)、非活跃的菱形体蛋白(inactive Rhomboid，iRhom)、菱形域包含蛋白(rhomboid domain containing，Rhbdd)等。

菱形体蛋白1表达于高尔基体，与果蝇rhomboid-1有相似的信号通路[2]；RHBDL2是在细胞质中发现的，作为跨膜丝氨酸蛋白酶，在细胞信号转导中起关键性的作用；RHBDL3是典型的胞内蛋白；RHBDL4最初被认为是一种线粒体蛋白，随后通过亚细胞分离和荧光显微镜分析确定了RHBDL4存在于内质网中[3]；PARL是线粒体菱形体蛋白酶，其定位于线粒体膜上[4]。iRhom有两个亚型，分别是iRhom1和iRhom2；Rhbdd3是属于一类含有菱形体结构域的蛋白家族，在调节自身免疫过程中有着重要作用[5]。

作为细胞内的蛋白酶，菱形体蛋白家族成员通过识别不同的底物，发挥着特异的生物学作用。RHBDL2的底物有Spitz(果蝇)、Gurken(果蝇)、血栓调节蛋白(Thrombomodulin)、Ephrion-B2和Ephrion-B3、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和ErbB-1；RHBDL4/RHBDD1的底物有BIK1、TSAP6、PreTCR、TCR、MPZ-L170R、opsin-degron、多囊蛋白-1(polycystin-1)、runcations；PARL的底物有OPAI、Omi/HtrA2、PINK1、磷酸甘油酸变位酶5 (phosphoglyceratemutase family member 5，PGAM5)；iRhom的底物有ADAM17[5-6]；RHBDL1和RHBDL3的底物尚不明确。在所有的菱形体蛋白中，研究相对比较清楚的是RHBDL2。

2 RHBDL2的生物学作用及与人类疾病的关系

RHBDL2是菱形体蛋白家族成员之一，广泛分布于原核生物和真核生物。研究表明RHBDL2能够激活哺乳动物的表皮生长因子受体；裂解膜内的EphrinB3、C型凝集素家族14成员A(C-type lection family 14 menber A，CLEC14A)；参与血栓调节蛋白的释放；调节内皮细胞的活性；裂解某些膜结合的底物而释放可溶性的生长因子；促进皮肤伤口愈合；其高表达可能会诱发肿瘤。

2.1 RHBDL2激活效应蛋白大多数表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)的配体可以水解释放蛋白激酶，调控多种信号的表达，产生不同的生物学效应。研究表明，EGF是哺乳动物菱形体蛋白RHBDL2的底物。在EGF的跨膜结构区域外，RHBDL2对其进行裂解，从而促进其激活，这直接证明了EGFR信号转导中有哺乳动物菱形体蛋白RHBDL2的参与[7]。EGFR途径在动物的生长发育中也有着重要的作用，高度的活跃表达可以诱导癌症的发生。RHBDL2可以通过刺激EGF激活EGFR信号，这可能和其致癌机制有关。RHBDL2在体外EGFR信号表达中是否起到关键作用，对其进行抑制作用是否可在癌症中提供新的治疗途径，是值得探究的新课题。

CLEC14A是单通道的跨膜糖蛋白，在肿瘤的内皮细胞中高表达。它可通过蛋白质的相互作用，促进和调节血管内皮细胞生成。Noy PJ[8]发现RHBDL2可以裂解CLEC14A，并且确定了RHBDL2裂解CLEC14A的蛋白位置。内源性裂解CLEC14A的缺失可以增加2倍的内皮细胞迁移率，促进血管内皮细胞的生成。RHBDL2对CLEC14A的裂解和调节，表明了RHBDL2能够调节蛋白质的分子结构，促进可溶性因子的释放，对内皮细胞的生成具有调控作用。

Lohi[2]等人确认了血栓调节蛋白是RHBDL2的一种蛋白底物，因为血栓调节蛋白上有EGF样区域，并且被菱形体蛋白识别。RHBDL2裂解血栓调节蛋白显示其可能在体外皮肤损伤方面具有调节作用，这种作用是通过刺激角化细胞迁移而完成的。

2.2 RHBDL2与人类疾病RHBDL2是一种进化保守、功能多样的水解蛋白酶。它能够调节表皮生长因子受体信号通路、内质网降解以及细胞的凋亡和增殖。RHBDL2通过特异性识别底物、控制膜内蛋白的降解而发挥一系列的细胞功能。在哺乳类动物蛋白分泌相关疾病中，RHBDL2起到了重要的作用。RHBDL2是膜内丝氨酸蛋白酶，能够在跨膜区裂解血栓调节蛋白，激活可溶性的血栓调节蛋白，促进皮肤创伤愈合[9]。菱形体蛋白与人类的肿瘤的发生机制有密切联系，通过激活或反向激活表皮生长因子信号通路调节细胞的凋亡和增殖[10]。研究表明乳腺癌细胞可以表达多种菱形体蛋白基因，尽管在正常乳房组织中有菱形体蛋白基因的表达，但某些菱形体蛋白基因的高表达，尤其是在特定的乳腺癌亚型中，可能会导致肿瘤的恶化。RHBDL2和PAPL对于乳腺癌肿瘤组织学分级有显著意义[11]。尽管菱形体蛋白能够被广谱丝氨酸蛋白酶抑制剂二氯异香豆素所抑制，但是二氯异香豆素的半衰期和毒性作用都限制了其进一步应用[12]，使得研究RHBDL2内源性的生物活性调控具有挑战性。细菌菱形体蛋白的体外药物筛选试验鉴定了β-lactams作为潜在先导化合物也能够抑制RHBDL2的活性[13]，这样在未来菱形体蛋白抑制剂作为治疗药物时会有更多的选择。

3 RHBDL1和 RHBDL3的初步认识及其底物探究

果蝇体内Rhomboid-1蛋白是一种生长因子激活剂，1998年在探究Rhomboid-1是否能够作为膜内蛋白酶时，对哺乳动物菱形体蛋白酶的第一个基因进行了克隆[14]。柔嫩艾美耳球虫体内也发现了Rhomboid-1存在，Rhomboid-1蛋白水解其底物MIC蛋白是虫体侵入宿主细胞的重要过程[1]，和果蝇基因相比较，这种未知功能的蛋白质命名为RHBDL1。目前对于RHBDL1的详细分子结构和具体生物学作用尚不清楚。

尽管RHBDL3异位表达的底物和RHBDL2有部分共同之处,但至今没有报告显示RHBDL3的蛋白酶水解活性。因此，迫切需要更有效的底物识别方法来解读RHBDL3的激活途径。人类大脑组织芯片分析揭示 RHBDL3基因表达与年龄和机体老化有联系，表明了菱形体蛋白活性和衰老表型有密切相关性[15]。此外，表达谱分析表明RHBDL3在胰腺发育过程中具有重要作用[16]。

4 RHBDL4的底物识别

哺乳动物的菱形体蛋白RHBDL4，也被称为RHBDD1，可促进膜蛋白的转运，包括从内质网到高尔基体，诱导EGFR配体TGF-α的转运，在细胞外微泡触发其分泌。研究表明， RHBDL4的信号转导是依赖G蛋白偶联受体完成的[17]。RHBDL4能够有效地裂解细胞内的淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)，导致β-淀粉样前体蛋白水平降低。同样地，APP 家族成员 APLP和APLP2也是RHBDL4的底物。APP是一种广泛表达的细胞表面蛋白，也是阿尔茨海默病发病的关键分子。探究RHBDL4调节APP 的过程，深刻了解APP 和菱形体蛋白的生理特点，对阐述阿尔茨海默病病理机制有重要的意义[18]。另外，RHBDL4是一个活跃的菱形体蛋白，能特异性识别并参与非典型且带正电荷的膜内质网相关降解(endoplasmic-reticulum-associated protein degradation，ERAD)。缬酪肽蛋白质(p97/VCP)和RHBDL4相互作用对于 ERAD途径的多聚泛素化底物修饰至关重要的[19]。ERAD途径是通过引导错误折叠和未结合的蛋白质从内质网到蛋白酶水解的一个重要的细胞保护机制。进化保守的菱形体家族蛋白RHBDL4位于膜内内质网，发挥泛素依赖性蛋白酶活性，调节内质网信号转导。RHBDL4能够裂解具有不稳定跨膜螺旋的单跨膜和多跨膜类的膜蛋白，从而导致其典型ERAD降解。

5 PARL的生物学功能与人类疾病的相关性

PARL是一种功能未完全清楚的线粒体内膜菱形体蛋白。PARL受PDK2调控以整合线粒体质量控制(Mitochonrial quality control，MQC)和代谢，对维持线粒体完整和正常细胞功能有着至关重要的作用[20]。淋巴细胞和神经细胞凋亡抑制过程需要bcl-2家族相关蛋白——HAX1(HS1 associated proteinX-1)和PARL参与。PARL和HAX1 形成的复合物能够募集线粒体丝氨酸蛋白酶HtrA2 /Omi，HtrA2 /Omi激活后可以诱导细胞凋亡。缺血后PARL的下调是缺血性神经元损伤的关键步骤，它减少HtrA2的加工并增加神经元的脆弱性[21]。PGAM5是线粒体丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，在线粒体膜电位损失时，其N末端跨膜结构域被切割。 PGAM5的线粒体膜电位损失依赖性切割是由PARL介导的[22]。PINK1和PARK2 / Parkin的突变是家族性帕金森病的主要危险因素。在PARL缺乏时，线粒体中PINK1的C末端氨基酸序列突变导致线粒体膜电位消散使线粒体受损，而诱导帕金森病。另外，帕金森病患者的部分基因测序发现PARL的N端功能域有一个新的错义突变。该突变可能通过线粒体自噬，导致神经退行性变，引起帕金森病的发生[23]。菱形蛋白是分布广泛和进化保守的膜内丝氨酸蛋白，它们在细菌、植物和动物细胞生长过程中发挥重要的调节作用，哺乳动物线粒体蛋白PARL对维持线粒体结构和功能完整性具有重要的意义[24]。

6 iRhoms的调节途径与人类疾病的相关性

iRhoms是内质网蛋白质，分为iRhom1和iRhom2两个亚型，参与多种细胞内外的信号转导，在多种情况下调节膜蛋白的运输。与其他Rhomboid蛋白酶家族成员相反，iRhom缺乏蛋白酶催化活性，并且作为伪蛋白酶，结合靶蛋白EGF并抑制EGF配体向高尔基体的易位[25]。肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor α，TNFα) 转换酶(tumor necrosis factor α conveting enzyme，TACE)属于含锌金属蛋白酶家族。研究表明，iRhoms是TACE活性必需的重要调节分子。iRhom2对于TACE运输和处理以控制造血细胞中的肿瘤坏死因子含量是至关重要的。iRhom2/TACE/Notch通路的研究，阐述了机械通气性肺损伤的作用机制，为临床诊断和治疗机械通气性肺损伤提供了理论依据[26]。iRhom2/TACE/TNFα通路机制还对血友病性关节炎的治疗有一定的影响，iRhom2的结构域的突变可以引起食道癌[27-28]。

7 Rhbdd3的生物学功能及与人类疾病的相关性

Rhbdd3是一类含有Rhomboid结构域的蛋白家族，首先在对垂体瘤中的基因甲基化筛选中被分离和鉴定出来，早期被称为垂体瘤凋亡基因(pituitary tumor apoptosis gene，PTAG)，定位于11号染色体，编码385个氨基酸。研究表明Rhbdd3抑制树突状细胞(Dendritic Cells，DC)的活化，从而抑制由Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)触发的白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)的产生。Rhbdd3缺陷型小鼠能够自发形成自身免疫性疾病，其特征在于辅助性T 细胞17(T helper cell 17,Th17)亚群的丰度增加。Rhbdd3通过与调控因子NEMO 蛋白Lys302位点连接的K27位多聚泛素链相互作用，抑制树突状细胞生成IL-6，由此调控自身免疫[29]。Rhbdd3广泛表达于免疫细胞，研究发现Rhbdd3在自然杀伤细胞中选择性上调Toll样受体3(Toll-like receptor 3，TLR3)，刺激后的细胞以反馈方式负向调节TLR3介导的自然杀伤细胞活化，从而抑制TLR3引发的急性肝损伤，提示Rhbdd3有可能够作为免疫稳态的维持者，为治疗肝脏炎症性疾病提供了一个新的机制。此外，Rhbdd3还可以通过泛素化途径影响DNAX激活蛋白12(DNAX activation protein of 12kDa，DAP12)的降解而增加DAP12的促癌作用。

8 结语

菱形体蛋白家族成员多以丝氨酸蛋白酶的形式发挥生物学作用。通过对其底物的加工修饰，参与许多重要的细胞进程。已有的研究表明，菱形体蛋白与人类的许多疾病尤其是恶性肿瘤密切相关，有可能成为新的研究靶点。