多糖结构分析的研究进展

霍琛鑫，刘忠义，严开川，梁启超

(牡丹江医学院药学院，黑龙江 牡丹江 157011)

多糖作为植物中重要的活性成分，具有较多活性作用，如抗肿瘤[1]、降血糖[2]、抗病毒[3]、抗氧化[4]以及提高免疫力等，要想更加深入的研究多糖的活性作用，就要对多糖的结构进行进一步的研究。结构是多糖活性的基础，多糖是由单糖脱水缩合而成，单糖种类众多，且单糖之间连接方式也不尽相同，因此，对多糖结构进行解析的难度也进一步增大。

1 多糖的单糖组成

研究多糖结构首先要研究多糖的单糖组成。单糖种类众多，常见的单糖有多种，如葡萄糖、岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖以及甘露糖等[5]，因此由各单糖组成的多糖也种类繁多，而单糖组成分析也就成了多糖结构研究的基础。通常用水解法通过完全水解将多糖链分解成单糖，水解后要经过中和、过滤、衍生化等处理，气相色谱法、薄层层析法、毛细管电泳法[6]以及高效液相色谱法[7]等是对多糖的单糖组成进行检测的较为常见的几种方法。最为常用的方法有气相色谱法和高效液相色谱法，两种方法能够较为确切的测出各单糖组分以及其摩尔比。HPLC用于单糖组成分析，自20世纪70年代开始便有研究，此法分离速度快，分辨率也较高，重现性也非常好，已经成为最为常用的分析方法[8]。唐华丽[9]等在对枸杞多糖的研究中，使用高效液相色谱法对十种单糖标准品和枸杞多糖亚组分LBP3样品进行分析，然后根据LBP3样品中所出的峰及其出峰时间与标准样品色谱峰及出峰时间进行逐一比对，经分析得出结论，认为此亚组分由D-甘露糖、D-葡萄糖、L-鼠李糖、D-木糖、D-半乳糖胺共同组成(其摩尔比是5.52:28.06:5.11: 1.70: 1)。薄层色谱法应用也较为广泛，可快速的鉴别出单糖的组成。肖作奇[10]等从矮地茶中提取得到多糖AJP，采用薄层色谱法和高效液相色谱法两种方法对矮地茶多糖进行分析，结果皆表明矮地茶多糖由葡萄糖和半乳糖组成，且高效液相色谱法结果表明其摩尔比值约为1: 2.36。

2 化学分析方法

2.1 高碘酸氧化和Smith降解多糖分子中的连二羟基或连三羟基可被高碘酸选择性的氧化断裂，相应生成多糖醛、甲酸，连二羟基的碳-碳键被氧化断裂生成醛，而连三羟基的碳-碳键被氧化断裂后生成醛和一分子甲酸，根据高碘酸的消耗量及甲酸的生成量，可判断多糖分子中糖苷键的位置和连接方式等结构信息[11]，所以高碘酸氧化反应常被用于多糖结构的研究。焦中高[12]在研究红枣多糖结构时，对其各级组分进行了高碘酸氧化反应，发现红枣多糖各级组分中均有甲酸产生，而且高碘酸的使用量与甲酸的产生量之比均大于3:1，因此认为其各级组分的主链均主要以1→4糖苷键连接，且存在1→6糖苷键，但支链的连接键型及分枝程度等有一些差异。在多糖结构的研究过程中，高碘酸氧化一般结合Smith降解法，Smith降解是将高碘酸氧化产物还原后进行水解，由水解产物可以推断出糖苷键的键型及其位置等信息[13]，以便进一步推测多糖分子结构。经 Smith降解后有甘油产生，则提示有1→6、1→2结合的糖苷键，但1→2位结合的无甲酸生成；若检测出丁四醇，则提示存在1→4 结合的糖苷键；若能检出单糖，如葡萄糖、半乳糖等，则提示有1→3结合的糖苷键[14]。李海雪[15]就是首先利用高碘酸氧化，推测桑椹多糖MFPA-1不存在1→6糖苷键，随后对其氧化反应产物进行Smith降解经气相色谱分析，推测MFPA-1中葡萄糖、甘露糖和鼠李糖主要以1→2糖苷键连接，阿拉伯糖和半乳糖主要以1→3糖苷键连接。

在早期，高碘酸氧化和Smith降解的应用较为常见，但是这两种方法需要依据反应产物进行推断，较为容易产生误差，且实验过程所需时间较长，以及实验规范性也对结果准确度有较大的影响，再加上现在许多实验室所配备的设备较为先进，所以近些年多糖结构解析研究中利用高碘酸氧化和Smith降解方法日渐减少。

2.2 甲基化分析甲基化分析是多糖结构分析最为经典和重要的方法之一，此法是通过甲基化试剂把多糖中各单糖残基上的游离羟基全部甲基化，再经过还原和乙酰化反应得到它们的衍生物，然后进行气相色谱-质谱检测分析，从而判断出各单糖的连接方式。同时，根据各单糖残基在产物中所占的比例，可以推测得到此连接方式的单糖在多糖中的分子比例[16]。孙永敢[17]等人以黑木耳为原料提取得到黑木耳多糖，并对其结构进行了分析，其甲基化结果表明黑木耳多糖的两个组分AAP3-20和AAP3-60分别含有不同的残基，AAP3-20有1，4，6-Glcp、1，3，6-Glcp、1，6-Glcp、t-Glcp这几种残基，AAP3-60则含t-Glcp、1，3-Xylp、1，4，6-Manp、1，4-Manp、1，6-Glcp。甲基化分析是判定多糖分子糖苷键连接方式的较为常用的方法，可将甲基化结果分析与其他方法的结果进行互相对比验证，从而使结果更加准确。高云霄[18]等人在对铁皮石斛多糖进行结构分析时，甲基化分析结果表明铁皮石斛多糖中只有吡喃糖的信号，其主要的葡萄糖和甘露糖均为吡喃糖。

3 仪器分析方法

3.1 红外光谱法随着仪器分析技术迅速发展，在多糖结构研究中仪器的应用也越来越普遍，且使用仪器进行分析灵敏度比较高，操作较为简单，准确度很高，成为多糖结构分析过程中最常用的方法之一。多糖结构的分析过程中离不开波谱，红外光谱法是解析多糖结构的一种重要手段。糖类结构中的一些特殊功能基团都呈现一些特异的红外吸收光谱，使用波数为4000cm-1～400cm-1的红外通过检测样品，对各段波数下透过样品光的强度进行测量，以波数为横坐标，以光的透射率为纵坐标，仪器记录下来的曲线即为红外光谱[19]。红外光谱在多糖结构解析上主要是识别多糖的官能团以及各类吡喃糖糖苷键构型[20]。伍芳芳[21]参照溴化钾压片法对猴头菇多糖HEP-W进行傅里叶变换红外光谱测定，图谱显示，3335cm-1处出现较宽的强吸收峰，2921cm-1以及1643 cm-1处出现弱吸收峰，这常用于判断该检测品是否为多糖。此外，在1405 cm-1与1066 cm-1的吸收峰分别归属为糖链上的C=C伸缩振动和吡喃环结构。913 cm-1的特征吸收峰归属为β-D-吡喃葡萄糖，而571 cm-1左右的吸收峰表明结构含有α-构型。由红外分析结果可以看出HEP-W同时具有α-型以及β-型糖苷键连接方式。

3.2 核磁共振波谱法核磁共振技术是又一重要的波谱分析方法，即使在没有结构背景知识的情况下，它也可以获得多糖最完全的结构信息，成为解决多糖结构复杂问题的最常用工具。此技术是20世纪中期发展起来的一种技术，该法最大的好处是不破坏多糖样品，因而能准确反映出多糖的真实结构，且能对多糖进行回收，因此是最为常用的多糖结构解析的方式。一般而言，1H- NMR 和13C- NMR 谱可得到糖类样品的整体结构信息，二维NMR谱(如COSY、HMQC、HMBC等)则能够得出相关碳氢连接方式等信息[23]。顾菲菲[24]等从赤芝中提取和分离纯化获得灵芝多糖组分LZJ-0.15，并通过核磁共振波谱法进行结构分析，1H-NMR和13C-NMR 谱图中异头氢的化学位移分别为δ4.4和δ4.7，异头碳的化学位移为δ102.5，从而推断LZJ-0.15主要由β糖苷键连接的吡喃型葡萄糖构成，结合二维谱图，推断 LZJ-0.15 主要为 β-(1→3) 和 β-(1→6) 连接的葡聚糖。自从核磁共振波谱技术应用到多糖研究中来，多糖结构分析发展迅速，相信在不久的将来，可以研究出由自动化分析代替人工分析的仪器，使多糖的结构分析更为简便，从而促进多糖研究的发展。

除上述方法外，电子显微镜法，X-射线衍射、拉曼光谱分析[25]以及酶学和免疫学方法[26]等分析方法在多糖结构研究中亦有广泛的应用。随着科学和技术的发展，多糖的结构研究会日趋简单、高效准确。