氢气联合自然杀伤细胞对肺癌细胞生长的影响

夏盛全 任涛 王凯玲 顾霞

同济大学附属东方医院呼吸内科,上海200123

氢气作为一种新型抗氧化剂,近年来受到越来越多的学者关注。它通过多种作用方式保护机体,在缺血再灌注损伤、神经系统损伤、电离辐射损伤、代谢综合征等疾病方面有着显著的预防和治疗作用[1]。自然杀伤 (natural killer,NK)细胞是构成机体免疫系统的重要成员,其不需要抗原预先致敏,不依赖抗体与补体,也无组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)限制性,能快速、直接杀伤肿瘤细胞,是机体肿瘤免疫中的第一道防线[2]。本研究通过氢气对非小细胞肺癌患者NK 细胞的增殖能力作用、杀瘤能力作用的研究,探讨氢气对非小细胞肺癌患者NK 细胞功能的影响,为今后的临床研究提供新思路,指导临床应用。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂 四甲基偶氮唑蓝 (methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒 (碧云天,C0009),酶标检测仪(Thermo MK3 型),PI(碧云天C1052),细胞培养箱 (Thermo Scientific 8000),光学显微镜(XDS-1A),倒置拍照显微镜 (Leica DMI3000B),低速离心机 (上海卢湘仪TDZ4B-WS),FACs CaliburTM流式细胞仪购自美国Becton Dickinson公司,双色荧光标记抗CD 分子单克隆抗体CD3-FITC/CD16+56+PE购自美国BD Bioscience公司。干扰素γ (interferon-γ,IFN-γ)试剂盒、IL-4试剂盒 (Elabscience),Matrigel BD Incorporated,USA,Transwell plate：Costar,Coring Incorporated,USA,氢气机(江苏无锡恒源生物)。

1.2 NK 细胞的分离与培养 抽取非小细胞肺癌患者外周血50 ml,用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞 (peripheral blood mononuclear cell,PBMC),计数后在含有IL-2、血清等的培养基及刺激因子包被的75 cm2培养瓶中进行培养扩增。第3～4天将细胞移入175 cm2培养瓶中,并补充新的培养基继续培养。第7～8天将细胞移入培养袋中,补充新的培养基继续培养,细胞置于37℃、5%CO2孵育箱中培养。第12～14天后取少许培养的NK 细胞用流式细胞仪进行检测,读出CD3-/CD16+CD56+的百分比。

1.3 氢气对NK 细胞增殖能力的作用 实验分为对照组：NK 细胞;实验组：NK 细胞+20%氢气组(20%氢气组)、NK 细胞+40%氢气组 (40%氢气组)、NK 细胞+60%氢气组(60%氢气组)。

1.3.1 MTT 检测细胞生长曲线变化 待NK 细胞长满后调整细胞浓度为5×104cells/ml,接种于96孔培养板,每孔100μl,37 ℃,5% CO2培养箱内培养24 h。按实验分组处理细胞,细胞放入不同浓度的氢气中培养2 h 后,放入37 ℃,5%CO2培养箱中培养12、24、36、48、72 h后进行MTT 检测。在每孔加入10μl的MTT,37 ℃,5%CO2培养箱内培养避光孵育4 h。在每孔加入100μl的Formazan溶解液,37 ℃,5%CO2培养箱内培养孵育4 h。酶标仪570 nm 波长测出同一时间点OD 值,用测得的OD 值进行细胞生长曲线的分析。

1.3.2 流式分析细胞周期 待细胞长满后调整细胞浓度为1×105cells/ml,接种于6孔培养板,每孔3 ml培养液,37 ℃,5% CO2培养箱内培养24 h。按实验分组处理细胞,细胞放入不同浓度的氢气中培养2 h后,放入37 ℃,5% CO2培养箱培养24、48 h后,进行周期检测。将孔板中的细胞收集至离心管中,1 000 r/min 离心3 min (离心半径15 cm),弃去培养液。将细胞沉淀用2 ml PBS洗涤1 次。离心去PBS,加入冰预冷的70%乙醇,4 ℃固定过夜。1 000 r/min离心3 min (离心半径15 cm),弃去固定液,用PBS 洗细胞,1 000 r/min离心3 min (离心半径15 cm)。加入500μl的PBS含100 mg/L RNase A,37 ℃孵育30 min。30 min后加入PI使其浓度为50 mg/L。避光37 ℃孵育30 min。冷PBS 溶液洗涤细胞,1 000 r/min 离心3 min (离心半径15 cm)。取200μl的单细胞悬液,流式上机检测,CELL Quest软件分析。

1.3.3 酶联免疫吸附试验 (enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)分析细胞分泌炎症因子的变化 按实验分组处理细胞,细胞放入不同浓度的氢气中培养2 h后,放入37℃,5%CO2培养箱中培养24 h后进行ELISA 检测。实验操作参考试剂盒说明书。

1.4 氢气对NK 细胞杀瘤能力的作用 实验分组为对照组：NK 细胞+A549细胞 (共培养比例为1∶1);实验组：NK 细胞+A549细胞 (共培养比例为1∶1)+20%氢气组、NK 细胞+A549细胞(共培养比例为1∶1)+40%氢气组、NK 细胞+A549细胞(共培养比例为1∶1)+60%氢气组。

1.4.1 单克隆形成能力变化 取处于对数生长期的细胞,将细胞悬浮于培养基中,计数3次,取平均值,调整细胞悬液浓度 (500 cell/个),接种时十字方向摇晃培养板,振动培养板边,使细胞尽量均匀分布。细胞按实验分组,处理方式按下述：NK 细胞+A549细胞 (共培养比例为1∶1)对照组为正常培养,20%氢气组、40%氢气组、60%氢气组为实验组,对实验组每天不同浓度通氢气2 h后,放入37 ℃,5% CO2培养箱中培养。细胞培养1周,每3天更换培养液,观察克隆形成情况。

1.4.2 划痕分析细胞迁移能力 先用marker笔在3.5 cm 皿背后,用直尺比着,均匀地划横线,大约每隔0.5～1 cm 一道,横穿过孔。每孔至少穿过5条线。在3.5 cm 皿加入约含3×105个细胞悬液,保证过夜细胞密度为90%。第2 天用200μl枪头比着直尺,尽量垂直于背后的横线划痕,枪头要垂直,不要倾斜。用PBS 洗细胞3 次,去除划下的细胞。细胞按实验分组,处理方式按下述：NK 细胞+A549细胞 (共培养比例为1∶1)对照组为正常培养,20%氢气组、40%氢气组、60%氢气组为实验组,对实验组每天不同浓度通氢气2 h后,放入37 ℃,5%CO2培养箱中培养。24 h后于倒置显微镜下观察划痕中细胞迁移情况。

1.4.3 Transwell分析细胞侵袭能力 人工基底膜制备：取出-20 ℃保存的Matrigel,将其在4 ℃下过夜解冻,在4 ℃进行操作;将无聚碳酸脂聚乙烯吡咯烷酮微孔滤膜 (微孔直径3μm)的Boyden小室放置到24孔培养板,形成上下两室。将制备的人工基底膜30μl加入每个Boyden小室的上室,37 ℃孵育2 h使其呈凝胶状。取处于对数生长期的细胞,调整细胞浓度为5×105cells/ml,接种于上室每孔200μl,下室加入1 ml的完全培养基,细胞按实验分组设计,于37 ℃,5% CO2培养箱内培养24 h。将细胞按以下处理方式：NK细胞+A549细胞(共培养比例为1∶1)对照组为正常培养,20%氢气组、40%氢气组、60%氢气组为实验组,对实验组每天不同浓度通氢气2 h后,放入37 ℃,5%CO2培养箱中培养。24 h后取出小室,吸弃上室液体,用棉签仔细擦净膜上未侵袭的细胞以及人工基底膜胶,37 ℃预温的PBS液漂洗2次,用冰预冷的4%多聚甲醛固定30 min,苏木素染色5 min。蒸馏水清洗后,于显微镜下观察拍照。

1.5 统计学分析 采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析。计量资料以±s表示,组间比较采用t检验,多组间比较采用F检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NK 细胞的流式细胞仪检测结果 由图1可知,CD3-/CD16+CD56+NK 细胞的表达水平为37.6%。

图1 自然杀伤细胞的流式细胞仪检测结果

2.2 氢气对NK 细胞增殖能力的作用

2.2.1 MTT 检测细胞生长曲线变化 通过MTT法检测NK 细胞生长曲线发现：12 h 时对照组、20%氢气组、40%氢气组、60%氢气组OD 值均为0.46±0.01;24 h 时对照组、20%氢气组、40%氢气组、60%氢气组OD 值均为0.54±0.01;36 h时对照组、20%氢气组、40%氢气组、60%氢气组OD 值均为0.63±0.01;48 h时对照组、20%氢气组、40%氢气组、60%氢气组OD 值均为0.85±0.01;72 h时对照组、20%氢气组、40%氢气组OD 值均为0.90±0.01,而60%氢气组OD 值为0.82±0.01,差异无统计学意义。见图2。

图2 四甲基偶氮唑蓝检测自然杀伤细胞生长曲线

与正常NK 细胞相比,60%的氢气处理NK 细胞后,从48 h后对NK 细胞增殖生长略显些抑制作用。40%及20%的氢气对NK 细胞增殖几乎没影响。

2.2.2 流式分析细胞周期 24 h后通过流式细胞仪检测NK 细胞周期发现,对照组、20%氢气组、40%氢气组、60%氢气组G0/G1期周期率分别为62.97%、63.28%、63.91%、61.93%;对照组、20%氢气组、40%氢气组、60%氢气组G2/M 期周期率分别为15.02%、13.97%、15.07%、14.50%;对照组、20% 氢气组、40% 氢气 组、60%氢气组S期周期率分别为22.01%、22.75%、21.03%、23.56% (图3)。48 h 后通过流式细胞仪检测NK 细胞周期发现,对照组、20%氢气组、40%氢气组、60%氢气组G0/G1期周期率分别为66.48%、67.99%、65.00%、67.71%;对照组、20%氢气组、40%氢气组、60%氢气组G2/M 期周期率分别为6.88%、6.57%、6.52%、8.88%;对照组、20%氢气组、40%氢气组、60%氢气组S期周期率分别为26.62%、25.43%、28.47%、23.41% (图4)。

由此可见,与正常NK 细胞相比,不同浓度的氢气处理NK 细胞后,对NK 细胞周期影响不大。

2.2.3 ELISA 分析细胞分泌炎症因子的变化 结果显示,对照组、20%氢气组、40%氢气组、60%氢气组IL-4浓度分别为 (8.07±0.38)、 (7.56±0.22)、(7.82±0.79)、 (7.31±0.38)ng/L;对照组、20% 氢气组、40% 氢气组、60% 氢气组IFN-γ浓度分别为 (20.90±1.28)、 (21.46±0.97)、 (21.09±0.37)、 (22.36±2.05)ng/L,差异均无统计学意义。见图5、6。

图3 24 h后流式细胞仪检测自然杀伤细胞周期结果

图4 48 h后流式细胞仪检测自然杀伤细胞周期结果

图5 酶联免疫吸附试验分析自然杀伤细胞分泌IL-4变化

图6 酶联免疫吸附试验分析自然杀伤细胞分泌干扰素-γ变化

与对照组相比,20%、40%、60%不同浓度的氢气处理NK 细胞后,对炎症因子IL-4、IFN-γ的释放影响不大。

2.3 氢气对NK 细胞杀瘤能力的作用

2.3.1 A549细胞单克隆形成能力变化 与对照组相比,60%的氢气处理共培养体系后,对A549细胞单克隆生长有轻度抑制作用,40%及20%的氢气对A549细胞单克隆生长能力没差别(图7)。

图7 A549细胞单克隆形成能力变化

2.3.2 划痕分析细胞迁移能力 与对照组相比,60%的氢气处理共培养体系后,对A549细胞迁移有轻度抑制作用,40%及20%的氢气对A549细胞迁移能力没差别(图8)。

2.3.3 Transwell分析细胞侵袭能力 与对照组相比,60%、40%及20%不同浓度的氢气处理对A549细胞侵袭能力没差别(图9)。

3 讨论

早在20世纪70年代,《科学》杂志首次发表了氢气作为自由基催化剂治疗应用的这一里程碑式的文章。在没有爆炸风险的情况下,连续吸入高压氢气(97.5%)2周使得动物皮肤肿瘤或白血病显著消退,并认为是通过氢气的抗氧化作用实现的[3]。2001年Gharib等[4]首次证明氢气具有抗炎作用,并不断表明了保护机制至少部分存在于氢分子与羟自由基的反应。2007 年Ohsawa等[5]深入阐明了常压下动物吸入2%的氢气具有选择性抗氧化特性,可有效地清除氧自由基,显著改善脑缺血再灌注损伤。近几年,对氢气的研究更是呈现井喷式发展,涉及多个领域和疾病,如缺血再灌注损伤、神经系统损伤、电离辐射损伤、动脉粥样硬化、炎症反应、消化系统、脓毒血症、失血性休克等[1,6-7]。氢气抗氧化的优点包括：(1)其生物膜高渗透能力和细胞内迅速扩散能力,使其能够达到亚细胞区如线粒体;(2)可以选择性地清除有害的羟自由基和过氧亚硝基阴离子,同时保留其他重要活性氧和氮物种的正常信号调节[5,8]。氢气现在被认为是一种信号气体分子,生理功能类似于一氧化氮、一氧化碳和硫化氢[9]。实际上,即使在高浓度下,氢气也没有细胞毒性,与其他气体相比,确保了安全特性[10]。

图8 划痕分析A549细胞迁移能力 A：迁移前;B：对照组;C：20%氢气组;D：40%氢气组;E：60%氢气组

图9 Transwell分析A549细胞侵袭能力 A：对照组;B：20%氢气组;C：40%氢气组;D：60%氢气组

NK 细胞作为天然免疫应答中关键的效应细胞,是一群不同于T、B淋巴细胞的大颗粒淋巴细胞,分布于外周各淋巴器官及血液循环系统,无需抗原的预先刺激与活化即可发挥细胞毒效应,并可分泌多种细胞因子及趋化因子。它可以非特异性杀伤肿瘤细胞,是机体免疫监视系统中的一个重要组成部分,同时能够产生IFN-γ和IL-4等细胞因子,参与机体免疫调节。其细胞表面标志主要是CD16和CD56[11-13]。近年来,关于NK 细胞过继性免疫治疗肿瘤的研究与日俱增,已逐渐开展临床应用并获得一定的疗效。

本研究选择了外周血CD16+CD56+为研究对象,观察20%、40%、60%不同浓度氢气对NK细胞的功能影响。由MTT 检测可知,与正常细胞相比,60%的氢气处理细胞,48 h 后对NK 细胞增殖生长略微有些抑制作用;而从细胞因子的分泌来看,60%氢气使NK 细胞分泌IFN-γ有些上升,使NK 细胞分泌IL-4有些下降,但均无统计学意义。而20%、40%的氢气无论对NK 细胞增殖还是细胞因子分泌上来看,均无明显影响。由流式细胞仪检测可知：与正常细胞相比,20%、40%、60%不同浓度的氢气处理NK 细胞后,对细胞周期影响不大。这说明20%、40%、60%不同浓度的氢气对NK 细胞的增殖无明显促进和抑制作用,对细胞周期影响不大。在NK 细胞与A549细胞共培养体系中,加入20%、40%、60%不同浓度氢气观察NK 细胞杀瘤能力,发现在A549细胞单克隆生长能力和细胞迁移能力方面,60%的氢气有轻度抑制作用,20%、40%浓度的氢气与NK 细胞和A549细胞正常培养的作用无差别。Transwell分析细胞侵袭能力方面,与NK 细胞和A549细胞正常培养相比,20%、40%、60%不同浓度的氢气处理对A549细胞侵袭能力没差别。最近有学者研究表明,氢气能抑制癌细胞增殖和转移,也能促进细胞发生凋亡。更有意思的是,氢气能诱导肺癌A549和H1975 细胞发生G2/M 阻滞[14]。细胞周期是一个受严密调控的有序发生的事件,基因组DNA 完成复制,随后基因组均等地分裂成2个相似的细胞。细胞周期调控需要大量的胞内外信号的配合,如果缺乏适当的信号,细胞将不能从一个阶段进入下一个阶段,这种现象称为细胞周期阻滞。本研究表明,在确保安全前提下,60%浓度的氢气联合NK 细胞有助于抑制A549细胞单克隆生长和细胞迁移能力,从而抑制肿瘤生长,它们之间存在的作用是否为协同作用,以及存在的作用机制需要今后科学研究和体内实验的开展进一步证实。

根据NK 细胞表面CD56密度的不同,可将其分CD56dim和CD56bright2种亚型,人体90%以上的NK 细胞为高表达IgG 低亲和力Fc 受体(FcγRⅢ,即CD16)且具有强烈的细胞毒效应的CD56dim细 胞,而可产生大量细胞因子的CD56bright细胞不到10%[15]。研究指出[16-17],CD56bright亚型的NK 细胞本身具有一定的抗氧化能力。本次研究只针对CD56+NK 细胞,未能细分CD56亚型,或许NK 细胞与氢气的抗氧化效应是否有协同作用尚未可知,但笔者观察到了60%高浓度氢气联合NK细胞有助于抑制A549细胞单克隆生长和细胞迁移能力,从而抑制肿瘤生长,达到治疗的目的。这为今后氢气和NK 细胞免疫治疗联合治疗肺癌奠定了实验基础。但氢气的浓度上限和体内试验疗效以及涉及的分子机制和信号通路有待于进一步研究和论证。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突