60Co-γ射线辐照灭菌对开胃健脾丸指纹图谱和有效成分含量的影响

2019-12-27黄湘杰

中国药业 2019年24期

舒婷，黄湘杰

（湖南省湘乡市人民医院药剂科，湖南湘潭 411400）

开胃健脾丸由白术、党参、陈皮、茯苓、甘草、山楂等13味中药材组方，有开胃健脾功效，临床多用于治疗脾胃不和、消化不良、食欲不振、嗳气吞酸等症［1］。方中君药白术的主要成分为白术内酯类、挥发性成分、苷类及多糖类等［2-3］；臣药党参的有效成分为党参炔苷［4-5］；2015年版《中国药典（一部）》以黄酮类的橙皮苷为陈皮的指标成分［6-8］。开胃健脾丸收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂（第五册）》［1］，质量标准中仅对该制剂的性状、显微鉴别和丸项通则检查进行了规定，不能全面、准确地评价其整体质量。中药指纹图谱法能较全面地反映出其内含化学成分的种类及数量，已广泛应用于中药质量监测和评价领域［9-11］。在开胃健脾丸的制备工艺中，大量使用到的炼蜜易受细菌微生物的污染，必须采取灭菌措施。常用灭菌方式有湿热灭菌、干热灭菌、辐射灭菌、环氧乙烷灭菌等，而60Co-γ辐照灭菌法作为中成药灭菌的一种新型高效方法，利用电离射线来破坏细菌中蛋白质的合成，从而达到杀菌效果，具有穿透力强、不需要添加任何化学试剂，且可在常温下进行灭菌等优点［12-14］。本研究中为考察60Co-γ射线对开胃健脾丸辐照灭菌的可行性，建立了开胃健脾丸高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，考察不同辐照剂量60Co-γ射线辐照灭菌对指纹图谱的影响，并比较制剂主要成分白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、党参炔苷和橙皮苷的含量变化，为开胃健脾丸采用60Co辐照灭菌提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司，包括G1311A型四元梯度泵、G1329A型自动进样器、G1314B-型二极管阵列检测器、G1316A型柱温箱、Agilent-Chemistation数据处理系统）；AUW-220D型电子天平（日本Shimadzu公司）；60Co-γ射线辐照设备（深圳市金鹏源辐照技术有限公司）；LRH-150B型生化培养箱（广东省医疗器械厂）；ZOZ-AB型电热恒温干燥箱（上海跃进医疗器械厂）；YJ-875型医用净化工作台（苏州净化设备厂）；KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司）；明澈-D24UV型纯水/超纯水一体化系统（德国默克密理博公司）。

1.2 试药

白术内酯Ⅰ对照品（批号为111975-201501，含量99.9%），白术内酯Ⅱ对照品（批号为111976-201501，含量99.9%），白术内酯Ⅲ对照品（批号为111978-201501，含量 99.9%），党参炔苷对照品（批号为111732-201607，含量99.9%），橙皮苷对照品（批号为110721-201316，含量95.3%），均购自中国食品药品检定研究院；沙氏琼脂培养基（批号为181209），胰酪胨大豆琼脂培养基（批号为180916），pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号为181221），均购自北京三药科技开发公司；乙腈为色谱纯；甲醇为优级纯；水为超纯水。开胃健脾丸［李时珍医药集团有限公司，批号分别为201712012（S1）、 201801132（S2）、 201802192（S3）、201804152（S4）、 20180562（S5）、 201806162（S6）、201809112（S7）、 201810232（S8）、 201811162（S9）、201812142（S10）、201711122（S11）、201710232（S12）、201709082（S13）、201901162（S14），规格为每瓶 60 g］。

2 方法与结果2.1

色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.5% 甲酸溶液（B），梯度洗脱（见表 1）；流速：1.0 mL/min；检测波长：220 nm（检测白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ及党参炔苷）、275 nm（检测白术内酯Ⅰ）、300 nm（检测橙皮苷）；柱温：30℃；进样量：10 μL；色谱记录时间：55 min［15-17］。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：称取待测成分对照品各适量，精密称定，用甲醇溶液超声（功率250 W，频率40 kHz，下同）溶解，制成白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、党参炔苷和橙皮苷质量浓度分别为0.4335，0.3486，0.3057，0.213 9，0.142 2 mg/mL的混合对照品溶液；分别精密量取 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，置 50 mL 容量瓶中，以甲醇定容，制得系列混合对照品溶液，室温保存备用。

供试品溶液：取样品及经不同辐照剂量处理的样品内容物各适量，剪碎，混匀，取约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定质量，超声处理40min，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，续滤液经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 方法学考察

精密度试验：取未经辐照的供试品溶液（S9）1份，按2.1项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。结果白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、党参炔苷和橙皮苷峰面积的RSD分别为0.35%，0.42%，0.57%，0.66%，0.48%（n=6）。以第1份指纹图谱为对照，计算6份图谱相似度，结果各图谱相似度均大于0.98，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：室温下取未经辐照的供试品溶液（S9），按 2.1 项下色谱条件，分别于 0，4，8，12，16，20，24 h时进样，记录色谱图，以0 h样品指纹图谱为对照，计算7份图谱的相似度，并计算5种有效成分峰面积的RSD。结果各图谱相似度均大于0.99，且白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、党参炔苷和橙皮苷峰面积的RSD分别为 0.57%，0.65%，0.82%，0.79%，1.02%（n=7），表明供试品溶液室温下放置24h内稳定性良好。

重复性试验：取同未经辐照的样品（S9）6份，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、党参炔苷和橙皮苷含量分别为1.001 7，0.643 9，0.552 1，0.460 4，0.298 9 mg/g，RSD分别为 0.67% ，0.59% ，1.02%，1.01%，0.86%（n=6）。以第 1份指纹图谱为对照，计算6份图谱相似度，结果相似度均大于0.96，表明方法重复性良好。

线性关系考察：精密量取系列质量浓度的混合对照品溶液10 μL，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以进样量（X）对峰面积（Y）进行线性回归，得回归方程和线性范围。精密量取混合对照品溶液，用甲醇逐步稀释，按2.1项下色谱条件进样分析，取峰面积信噪比（S/N）10∶1计算定量限。结果见表2。

表2 5个有效成分的线性范围和定量限

加样回收试验：取样品（S9）6份，每份 1.0 g，精密称定，精密加入各待测成分对照溶液2.0 mL，依法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图并计算加样回收率。结果见表3。

表3 开胃健脾丸5个成分的加样回收试验结果（n=6）

2.4 指纹图谱建立及部分共有峰指认

取14批经0，3，5，8 kGy剂量辐照处理的样品适量，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。将指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012 A版）软件，设置时间窗为0.2 min，采用中位矢量法多点校正，分别生成各对照指纹图谱。详见图1。

指纹图谱中，14批供试品均检测到24个共有峰，通过与对照品比对，可确认5号峰为橙皮苷（12.215 min），15号峰为白术内酯Ⅲ（26.005 min），16号峰为白术内酯Ⅱ（29.011 min），17 峰为白术内酯Ⅰ（30.946 min），23号峰为党参炔苷（39.107 min）。

图1 开胃健脾丸高效液相色谱指纹图谱

取供试品指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012 A版）软件，以未辐照（0 kGy）样品图谱为参照，经多点校正，全谱段峰匹配，生成对照图谱，计算各批不同辐照剂量与对照指纹图谱的相似度。结果见表4。可见，辐照前后各批次指纹图谱与对照指纹图谱相似度均大于0.90，相似度良好。

表4 指纹图谱相似度计算结果

2.5 样品含量测定

取样品及60Co-γ射线辐射灭菌样品各适量，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定样品中白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、党参炔苷和橙皮苷含量，利用SPSS 19.0统计学软件对灭菌前后的含量进行配对t检验，考察 0，3，5，8 kGy辐照剂量60Co-γ 射线辐射灭菌对各化合物含量的影响。结果见表5。

2.6 含菌量测定

分别取辐照前后的样品，参照2015年版《中国药典（四部）》“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”［18］进行需氧菌总数以及霉菌和酵母菌总数考察。分别加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，浸泡分散，充分振摇，按10倍培养基稀释法检查制成1∶10、1∶100、1∶1 000的待测液，依法测定需氧菌总数以及霉菌和酵母菌总数。测定结果见表6。

表5 开胃健脾丸5个成分含量测定结果（mg/g）

3 讨论

3.1 灭菌效果检查

60Co-γ射线辐照灭菌处理后，需氧菌以及霉菌和酵母菌总数均大幅减少，且随着辐照剂量的增加，样品的含菌量显著减少，表明60Co-γ射线辐照能有效除去开胃健脾丸中的微生物。

续表5 开胃健脾丸5个成分含量测定结果（mg/g）

表6 样品辐照前后含菌量测定结果

3.2 辐照剂量选择

根据卫生部颁布的《60Co辐照中药灭菌剂量标准》的规定，中药的辐照剂量应水平10 kGy。本研究中分别采用3，5，8 kGy剂量进行辐照，考察其对指纹图谱和指标成分的影响，并确定最佳灭菌处理参数。开胃健脾丸经不同剂量60Co-γ射线辐射处理后，0，3，5 kGy辐照处理过的供试品指纹图谱相似度均大于0.95，而辐照剂量为 8 kGy时，相似度平均值为 0.900 6（小于0.95），表明虽然指纹图谱共有峰数量没有变化，但与未经辐照的供试品比较，相似度已有所下降。辐照前后开胃健脾丸中5个成分含量无显著性变化（P＞0.05），故从含量和共有峰数量方面可以看出，辐照灭菌对开胃健脾丸无影响。