子宫内膜癌患者血清miR-205检测方法的建立*

李 军，蔡 虎

（1.陕西省药品技术审核查验中心，陕西 西安 710065； 2.陕西省医疗器械质量监督检验院，陕西 西安 712046）

MicroRNA（miRNA）是一种内源性非编码单链小分子RNA，其5′端为磷酸基团、3′端为羟基基团，长度为21～25个核苷酸。miRNA主要通过结合mRNA来抑制蛋白翻译过程或酶解切割mRNAs来调控基因的表达［1］。最新研究表明，miR-205在许多类型的癌症中均异常表达，如头颈部肿瘤、鳞状细胞癌、膀胱肿瘤和子宫内膜癌等［2-4］。子宫内膜癌为最常见的妇科肿瘤，占妇科恶性肿瘤的20%～30%，严重威胁女性健康。子宫内膜癌好发于绝经后妇女，但近年来发病人群有年轻化趋势，且其发病率不断上升。本研究中建立了荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）法，检测miR-205在子宫内膜癌患者血清中的表达，探讨能否将miR-205作为新的肿瘤标志物，用于子宫内膜癌的早期诊断。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 样本血清、仪器与试剂

样本血清：以择期行妇科手术的8例子宫内膜癌患者为试验组，年龄36～65岁，平均44岁；以10例健康者为健康对照组，年龄38～52岁，平均45岁。上述研究对象均取外周静脉血3mL，常规分离血清，于-80℃贮存。

仪器：CFX384型荧光定量聚合酶链式反应（RTPCR）仪（美国BioRad公司）；DU 700型紫外分光光度计（美国Beckman Coulter公司）；CT15RE型高速冷冻离心机（日本Hitachi公司）；MDF-U5412型-80℃低温冰箱（日本 Sanyo公司）；MX-S型涡旋振荡器（美国Sciloge公司）；EPOCH型酶标仪（美国BioTek公司）。

试剂：Trizol（日本 Takara 公司，批号为 9108）；miR-205，U6 Primer（广州锐博生物科技有限公司）；逆转录试剂和 SYBR Green PCR reagents（日本Toyobo公司）；C反应蛋白酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（上海雅吉生物科技有限公司，批号为XS01804）；基质金属蛋白酶2（MMP-2）ELISA试剂盒（上海户实医药科技有限公司，批号为HS3345）；氯仿、异丙醇、无水乙醇、焦碳酸二乙酯（DEPC）、水（华美生物工程有限公司）。

1.2 方法

总RNA的提取：取样本血清300 μL，加入Trizol试剂1 mL，振荡裂解细胞，室温静置30 min；加入氯仿200 μL 混匀，冰置 10 min。4 ℃下，12 000 r/min离心10 min；取上清液 200 μL，加异丙醇 200 μL，上下颠倒混匀，冰置 15 min；4 ℃下，12 000 r/min 离心 10 min；弃上清液，加DEPC水1 mL配制的75%乙醇混匀，4℃下，12 000 r/min离心10 min；弃上清液，冰上晾干5～10 min，加入 DEPC 水 20～30 μL 溶解 RNA。在 260 nm和280 nm波长处检测吸光度（OD）值，确定RNA的纯度和浓度。

cDNA的合成：逆转录反应体系为20 μL，5×逆转录缓冲液 4 μL，dNTP 0.75 μL，miR-205 逆转录引物1.2 μL，M-MLV 逆转录酶 0.2 μL，总 RNA 样本 5 μL，DEPC 水 8.85 μL。反应条件为 16 ℃、30 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min。

血清中miR-205含量的检测：PCR反应体系（10 μL）为 SYBR 5 μL，上下游引物各 0.4 μL，cDNA 模版 1 μL，Taq DNA 聚合酶 0.1 μL，DEPC 水 3.1 μL。反应条件为95℃预变性3 min，95℃变性12 s，62℃退火50 s，循环40次。反应结束后，定量分析PCR获得的熔解曲线和扩增曲线的可靠性，并设定循环阈值（Ct），以miR-205/Ub比值代表其相对表达水平，2-△△Ct法计算其相对表达量。

血清中CRP和MMP-2含量的检测：取样本血清适量，各孔加入相应待测样本血清40 μL及抗CRP和MMP抗体10 μL，每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体50 μL，以封板膜封住反应孔，37℃孵育1 h；弃上清液，重复洗5次；每孔加入底物 A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min；每孔加入终止液50 μL，15 min内用酶标仪测定在450 nm波长处的OD值。以OD值代表其相对含量。设立对照孔。

1.3 统计学处理

采用Graphpad Prism 5统计学软件分析。

2 结果

2.1 样品纯度

样品总 RNAOD260/OD280在 1.8～2.0之间（见表1），表明提取纯度较好，RNA几乎无降解，可进行下一步的实时荧光定量PCR。

表1 样品总RNA质量浓度（ng/μL）

2.2 引物特异性

miR-205和U6的熔解曲线峰值单一，未见其他杂峰信号；miR-205熔解温度为75.4℃，U6熔解温度为80.3℃（见图1）。说明本试验中设置的RT-PCR参数合理，miR-205、U6逆转录引物和扩增引物能成功扩增出对应的片段，产物特异性较好，试验结果较可靠。

2.3 miR-25表达水平

健康对照组产生微弱的非特异性信号，且明显滞后于试验组。试验组患者血清中miR-205的表达水平显著高于健康对照组（P＜0.05）。详见图2。

2.4 CRP和MMP-2含量

试验组患者血清CRP的含量为5.367 mg/L，显著高于健康对照组的 2.432 mg/L（P＜0.05），两组的MMP-2含量无显著差异（P＞0.05）。详见图3。

图1 熔解曲线

图2 miR-205表达水平

图3 CRP和MMP-2含量

3 讨论

子宫内膜癌的发病机制尚未明确，目前尚无有效的预防机制。miRNA是一类非编码小分子RNA，其通过碱基互补配对结合特异的靶向mRNA，从而抑制靶向mRNA的翻译或降解靶向mRNA，从而发挥其癌基因或抑癌基因的功能。

有研究利用miRNA芯片技术发现，子宫内膜癌患者的血清中有多个miRNA表达上调，其中miR-205的上调最显著［5］。也有报道 miR-205和 miR-342可作为诊断三阴性乳腺癌的潜在生物标志物［6］，miR-205通过靶向ZEB1和Ubc13作为肿瘤的放射致敏剂［7-8］。miR-205下调可明显抑制肿瘤细胞的增殖与迁移，且能促进抑癌基因JPH4的表达，从而抑制子宫内膜癌的发生及发展［3-4］。也有研究发现，在子宫内膜癌细胞抑制靶向Akt-mTOR通路的miR-205，为孕激素受体型子宫内膜癌提供了一种潜在的、新的治疗方法［9］，miR-205通过靶向 PTEN 调控人子宫内膜癌［10］。SU 等［11］发现，miR-205通过靶向子宫内膜癌中的抑癌基因ESRRG促进了肿瘤的增殖和侵袭。

本研究中建立了RT-PCR法检测血清中的miR-205，该方法快速便捷、灵敏度高、特异性好。但由于样本量较少，今后还需增加样本量进一步证明该方法的稳定性。同时，本研究中发现CRP在子宫内膜癌患者的血清中异常高表达。由于miR-205与肿瘤浸润相关，而CRP也与肿瘤浸润转移有关，因此推测子宫内膜癌患者miR-205的异常表达可能是由于CRP的高表达引起。由于miR-205在多种肿瘤中存在表达异常，能否通过两种或多种miRNA联合诊断子宫内膜癌的设想，也为今后的临床研究提供了新的思路。