微小RNA-124-3p通过靶向抑制RIPK1的表达对缺氧/复氧心肌细胞损伤中的保护作用及其机制研究

2019-12-27汪鲁青姜花郑生

中国循证心血管医学杂志 2019年11期

汪鲁青，姜花，郑生

急性心肌梗死等多种心血管疾病患病率逐年升高，目前临床常采用溶栓及经皮冠状动脉介入等方法进行治疗，目的是促使缺血的心肌恢复血液供应，一旦缺血的心肌恢复正常可造成局部心肌缺血组织损伤而引发心肌缺血再灌注损伤[1]。因而如何解决缺血再灌注损伤引发的心肌细胞损伤成为目前研究的重点问题。研究表明微小RNA（miRNA）在心肌缺血再灌注损伤过程中异常表达并可能参与心肌缺血、心力衰竭、心脏发育等多种生理病理过程[2]。研究表明高糖引起肾小球内皮细胞微小RNA-124（miR-124）表达下降，过表达miR-124可减轻高糖所致的肾小球内皮细胞损伤[3]。微小RNA-124-3p（miR-124-3p）可保护神经细胞[4]。但关于miR-124-3p在心肌缺血再灌注损伤过程中的作用机制尚未见相关报道。缺氧/复氧（H/R）处理可上调心肌细胞中受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）的表达，抑制RIPK1表达可保护H/R诱导的心肌细胞损伤[5]。研究表明RIPK1在肝损伤中呈高表达[6,7]。靶基因预测结果显示RIPK1可能是miR-124-3p的靶基因，但关于miR-124-3p是否调控RIPK1表达进而参与心肌缺血再灌注损伤过程尚未可知。因此，本研究构建H/R模型，观察miR-124-3p与RIPK1在H/R诱导的心肌细胞中的表达变化，并探究其表达对心肌细胞损伤的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂大鼠心肌细胞H9C2购自上海雅吉生物科技有限公司。DMEM培养基购自北京索莱宝生物科技有限公司；miR-124-3p mimics、miR-124-3p抑制剂（anti-miR-124-3p）、si-RIPK1及其各自阴性对照均购自广州锐博生物科技有限公司；Lipofectamine2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；胎牛血清、青霉素及链霉素均购自上海远慕生物科技有限公司；Trizol试剂、RNA反转录试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司；实时荧光定量PCR试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；RIPA蛋白裂解液与BCA蛋白定量试剂盒均购自北京康为世纪生物科技有限公司；兔抗鼠B淋巴细胞瘤-2 （Bcl-2）、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白（Bax）、RIPK1抗体均购自美国CST公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司；乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）检测试剂盒均购自南京建成有限公司；膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（FITC）细胞凋亡试剂盒购自南京凯基有限公司。

1.2 方法

1.2.1 缺氧/复氧（H/R）模型建立将不含血清的低糖DMEM培养基放入37℃、体积分数5%CO2培养箱内培养，加入95%体积分数的氮气，持续通入上述气体3 h，更换DMEM高糖培养基，放入低氧装置内继续培养3 h（缺氧），随后将培养基更换为含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，放入37℃、体积分数5%CO2培养箱继续培养4 h（复氧）[8]。同时将未进行任何处理的心肌细胞作为Con组。

1.2.2 实验分组取对数生长期心肌细胞，参照Lipofectamine 2000转染试剂说明书向心肌细胞分别转染miR-124-3p mimics、si-RIPK1及其各自阴性对照，随后按照H/R处理方法进行处理，分别为H/R+miR-124-3p组、H/R+miR-NC组、H/R+si-RIPK1组、H/R+siNC组。同时将miR-124-3p mimics与pcDNA-RIPK1、miR-124-3p mimics与pcDNA分别共转染入心肌细胞，同上述处理方法进行处理，分别为H/R+miR-124-3p+pcDNARIPK1组、H/R+miR-124-3p+pcDNA组。转染6 h后将培养液更换为含有10%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养48 h后收集对数生长期细胞进行后续研究。

1.2.3 qRT-PCR检测细胞中miR-124-3p、RIPK1 mRNA表达水平分别收集各组心肌细胞，采用Trizol法提取心肌细胞总RNA，参照反转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板进行qRTPCR反应，反应体系共20 μl：cDNA模板2 μl，正反向引物各0.6 μl，SYBR Green Master Mix 10 μl，ddH2O 6.8 μl。反应条件：95℃ 5 min（循环1次），95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s（循环40次）。观察荧光曲线及Ct值，采用2-ΔΔCt法计算miR-124-3p、RIPK1 mRNA的相对表达量。

1.2.4 荧光素酶报告基因检测靶基因预测库预测miR-124-3p与RIPK1的3’UTR存在结合位点，将含有miR-124-3p结合位点及其突变位点的RIPK1的3’UTR片段插入PGL3荧光素酶报告基因载体，分别构建野生型（WT-RIPK1）与突变型（MUT-RIPK1）的RIPK1 3’UTR荧光素酶报告载体，将WT-RIPK1、MUT-RIPK1分别与miR-124-3p mimics、miR-NC共转染，培养箱内培养48 h，收集细胞，根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书检测各组心肌细胞的荧光素酶活性。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡收集各组对数生长期心肌细胞，采用0.25%胰蛋白酶消化细胞，收集心肌细胞计数，低温下经1000 r/min转速离心5 min（离心半径10 cm），弃上清，加入Annexin Binding buffer重悬细胞，调整细胞密度（1×106个/ml），吸取1 ml细胞悬液加入5 μl Annexin V-FITC，充分混匀后加入5 μl PI，充分混匀，室温避孵育20 min，应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6 蛋白免疫印迹检测RIPK1、Bcl-2、Bax蛋白表达取各组心肌细胞，加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白，根据BCA试剂盒定量蛋白，取30 μg蛋白上样进行SDS-PAGE凝胶电泳反应，蛋白转移至PVDF膜，室温封闭1 h，孵育一抗（1:1000），4℃孵育24 h，TBST洗膜，孵育二抗（1:3000），室温孵育2 h，ECL显影，放入凝胶成像系统并应用Quantityone软件检测条带灰度值。

1.2.7 检测细胞LDH、MDA、SOD含量收集各组心肌细胞，应用超声破碎细胞，参照LDH、MDA、SOD试剂盒说明书检测MDA、SOD的水平及LDH活性，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计学处理利用SPSS 21.0统计软件分析数据。计量资料以（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间差异采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-124-3p和RIPK1在缺氧/复氧处理对心肌细胞中的表达与Con组相比，H/R组心肌细胞中miR-124-3p的表达水平显著降低（P＜0.05），而RIPK1 mRNA及蛋白水平均显著升高（P＜0.05）（图1，表1）。

图1 RIPK1蛋白表达

表1 miR-124-3p和RIPK1在缺氧/复氧处理对心肌细胞中的表达（±s，n=9 ）

分组 Con H/R P值miR-124-3p 1.02±0.09 0.39±0.04 ＜0.001 RIPK1 mRNA 1.00±0.08 2.86±0.27 ＜0.001 RIPK1蛋白 0.49±0.04 0.91±0.08 ＜0.001

2.2 miR-124-3p靶向调控RIPK1的表达靶基因预测显示RIPK1的3’UTR存在miR-124-3p的结合位点（图2A）。双荧光素酶报告基因实验检测结果显示，与共转染miR-NC、WT-RIPK1的心肌细胞相比，共转染miR-124-3p mimics与WT-RIPK1的心肌细胞荧光素酶活性显著降低（P＜0.05）；与共转染miR-NC、MUT-RIPK1的心肌细胞相比，共转染miR-124-3p mimics与MUT-RIPK1的心肌细胞荧光素酶活性无明显变化（P＞0.05）（表2）。表明miR-124-3p可靶向结合RIPK1，并可调控其活性表达。Western blot实验结果显示，相较于miR-NC组，miR-124-3p组心肌细胞中RIPK1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与anti-miR-NC组相比，anti-miR-124-3p组心肌细胞中RIPK1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）（图2B、表3）。

图2 miR-124-3p靶向调控RIPK1的表达

表2 双荧光素酶报告实验（±s，n=9 ）

分组 miR-NC miR-124-3p P值WT-RIPK1 1.04±0.08 0.41±0.03 ＜0.001 MUT-RIPK1 1.03±0.07 1.01±0.09 0.606

表3 miR-124-3p调控RIPK1蛋白的表达（±s，n=9 ）

注：与miR-NC组比较，aP＜0.05；与anti-miR-NC组比较，bP＜0.05

分组 miR-NC miR-124-3p anti-miR-NC anti-miR-124-3p P值RIPK1蛋白0.48±0.05 0.19±0.02a 0.48±0.05 0.89±0.08b ＜0.001

图3 miR-124-3p过表达对缺氧/复氧心肌细胞凋亡的影响

2.3 miR-124-3p过表达对缺氧/复氧心肌细胞损伤的影响流式细胞术检测结果显示，H/R组心肌细胞凋亡率较Con组显著增加（P＜0.05），而H/R+miR-124-3p组心肌细胞凋亡率较H/R+miRNC组显著降低（P＜0.05）（图3B、表4）。与Con组相比，H/R组心肌细胞LDH活性明显增强（P＜0.05），MDA水平明显升高（P＜0.05），而SOD水平明显降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平明显降低（P＜0.05），而Bax蛋白水平明显升高（P＜0.05）；与H/R+miR-NC组相比，H/R+miR-124-3p组心肌细胞LDH活性明显降低（P＜0.05），MDA水平明显降低（P＜0.05），而SOD水平明显升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平明显升高（P＜0.05），而Bax蛋白水平明显降低（P＜0.05）（图3A、表4）。表明miR-124-3p过表达了明显抑制心肌细胞凋亡并减缓心肌细胞氧化应激反应。

2.4 抑制RIPK1对缺氧/复氧心肌细胞损伤的影响Western blot实验结果显示，H/R+si-RIPK1组心肌细胞中RIPK1蛋白水平与H/R+siNC组相比显著降低（P＜0.05），提示成功抑制H/R诱导的心肌细胞中RIPK1的表达。与H/R+siNC组相比，H/R+si-RIPK1组心肌细胞LDH活性明显降低（P＜0.05），MDA水平与细胞凋亡率均明显降低（P＜0.05），而SOD水平明显升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平明显升高（P＜0.05），而Bax蛋白水平明显降低（P＜0.05）（图4、表5）。

2.5 RIPK1过表达逆转了miR-124-3p过表达对缺氧/复氧心肌细胞损伤的作用相较于H/R+miR-124-3p+pcDNA组，H/R+miR-124-3p+pcDNARIPK1组心肌细胞LDH活性、MDA水平、细胞凋亡率及Bax蛋白水平均明显升高（P＜0.05），而SOD水平及Bcl-2蛋白水平均显著降低（P＜0.05）（图5、表6）。

表4 miR-124-3p过表达对缺氧/复氧心肌细胞损伤的影响（±s，n=9 ）

注：与Con组比较，aP＜0.05；与H/R+miR-NC组比较，bP＜0.05

分组 Con H/R H/R+miR-NC H/R+miR-124-3p P值miR-124-3p 1.02±0.09 0.36±0.03a 0.34±0.04 0.81±0.08b ＜0.001 LDH（U/L） 12.48±1.35 63.25±6.28a 66.87±6.94 21.58±2.67b ＜0.001 MDA（nmol/mg prot） 3.54±0.34 21.65±2.04a 23.68±2.13 8.69±0.87b ＜0.001 SOD（U/mg prot） 19.65±1.89 6.32±0.61a 6.23±0.57 16.35±1.59b ＜0.001 Bcl-2蛋白 0.74±0.07 0.35±0.03a 0.33±0.03 0.62±0.06b ＜0.001 Bax蛋白 0.28±0.03 0.61±0.06a 0.63±0.06 0.39±0.04b ＜0.001凋亡率（%） 7.32±0.72 23.65±2.37a 25.74±2.48 11.72±1.36b ＜0.001

图4 RIPK1和凋亡相关蛋白表达

图5 RIPK1和凋亡相关蛋白表达

表5 抑制RIPK1对缺氧/复氧心肌细胞损伤的影响（±s，n=9）

注：与Con组比较，aP＜0.05；与H/R+siNC组比较，bP＜0.05

分组 Con H/R H/R+si-NC H/R+si-RIPK1 P值RIPK1蛋白 0.43±0.04 0.88±0.08a 0.92±0.08 0.51±0.05b ＜0.001 LDH（U/L） 13.65±1.27 65.47±6.29a 67.21±6.38 27.65±2.57b ＜0.001 MDA（nmol/mg prot） 4.03±0.39 23.65±2.24a 25.17±2.52 10.65±1.03b ＜0.001 SOD（U/mg prot） 21.36±2.11 6.98±0.68a 6.81±0.62 14.28±1.13b ＜0.001 Bcl-2蛋白 0.75±0.07 0.32±0.03a 0.29±0.03 0.57±0.05b ＜0.001 Bax蛋白 0.25±0.03 0.64±0.06a 0.65±0.06 0.42±0.04b ＜0.001凋亡率（%） 6.27±0.59 22.36±2.38a 23.14±2.09 14.58±1.43b ＜0.001

表6 RIPK1过表达逆转了miR-124-3p过表达对缺氧/复氧心肌细胞损伤的作用（±s，n=9）

注：与H/R+miR-NC组比较，aP＜0.05；与H/R+miR-124-3p+pcDNA组比较，bP＜0.05

分组 H/R+miR-NC H/R+miR-124-3p H/R+miR-124-3p+pcDNA H/R+miR-124-3p+pcDNA-RIPK1 P值RIPK1蛋白 0.89±0.08 0.34±0.03a 0.32±0.04 0.78±0.07b 0.000 LDH（U/L） 65.28±6.47 20.36±2.18a 19.57±2.09 48.25±4.39b 0.000 MDA（nmol/mg prot） 22.69±2.14 8.36±0.84a 8.12±0.79 17.25±1.57b 0.000 SOD（U/mg prot） 6.34±0.64 17.26±1.58a 18.28±1.67 12.54±1.38b 0.000 Bcl-2蛋白 0.30±0.03 0.67±0.06a 0.69±0.05 0.41±0.04b 0.000 Bax蛋白 0.61±0.06 0.33±0.03a 0.32±0.03 0.49±0.04b 0.000凋亡率（%） 24.18±2.09 12.46±1.25a 11.29±1.18 18.67±1.69b 0.000

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤可引发心律失常、心肌梗死等多种疾病，且严重降低患者生活质量[9]。因而积极探寻有效防治心肌缺血再灌注损伤的治疗措施对降低心血管疾病死亡率具有重要现实意义。miRNA表达上调或下调可影响心血管疾病发生及发展过程，通过抑制或促进部分miRNA表达可有效调控心血管疾病发展进程[10]。因此积极寻找miRNA与心血管疾病发生及发展的关系，可为心血管疾病治疗提供潜在靶点。

miR-124在动物神经系统内特异性表达，其表达异常与神经系统疾病发生及发展密切相关[11]。研究表明miR-124-3p过表达可通过靶向FIP200表达进而保护神经元细胞[12]。miR-124-3p通过调节ANAX5表达可在6-羟基多巴胺诱导的帕金森病细胞模型中发挥神经保护作用[13]。研究报道指出miR-124-3p上调表达可逆转缺氧期间细胞依赖的凋亡途径[14]。本研究结果显示H/R处理的心肌细胞中miR-124-3p的表达水平降低，细胞中LDH活性与MDA水平均明显升高，而SOD水平明显降低，通过上调miR-124-3p表达，结果发现心肌细胞中LDH活性明显降低，MDA水平明显降低，而SOD水平显著升高，说明miR-124-3p过表达可逆转H/R对心肌细胞氧化损伤的作用。已有研究表明心肌细胞缺氧可导致心肌细胞膜受损，心肌细胞复氧可造成细胞氧化损伤而促使细胞膜通透性增加，LDH是心肌细胞标志酶，SOD属于抗氧化酶类，其可通过清除超氧阴离子而保护机体免受氧化损伤，MDA属于氧化酶类，其主要是氧自由基攻击细胞膜不饱和脂肪酸的产物，其水平高低与细胞氧化损伤程度呈正相关[15]。提示H/R可导致心肌细胞脂质过氧化反应增强进而加重细胞损伤，miR-124-3p过表达可增强心肌细胞清除氧自由基能力并减轻细胞膜脂质过氧化反应进而在H/R发生过程中发挥保护作用。同时本研究发现H/R处理后心肌细胞凋亡率显著增加，而上调miR-124-3p表达后心肌细胞凋亡率显著下降，Bcl-2蛋白水平显著升高，而Bax蛋白水平显著降低，说明H/R可诱导心肌细胞凋亡，miR-124-3p过表达可抑制心肌细胞凋亡。研究报道指出Bcl-2表达水平升高可抑制心肌细胞凋亡，而Bax表达水平升高可促进心肌细胞凋亡[16]。提示miR-124-3p过表达可通过调控细胞凋亡相关蛋白表达进而抑制H/R所致的心肌细胞凋亡。

细胞程序性坏死与RIPK1、RIPK3表达异常有关，研究表明程序性坏死可参与心肌缺血等多种疾病发生及发展过程，通过抑制RIPK1表达可明显减缓大鼠心肌缺血再灌注损伤[17,18]。心肌缺血再灌注损伤发生过程中心肌细胞中RIPK1的表达水平明显升高，并可激活程序性坏死途径导致心肌梗死、心力衰竭等多种心血管疾病发生及发展过程。与上述研究结果相似，本研究结果显示H/R诱导的心肌细胞中RIPK1的表达水平显著升高，通过抑制RIPK1表达发现心肌细胞凋亡率、LDH活性、MDA水平及Bax蛋白水平均显著降低，而SOD水平及Bcl-2蛋白水平均显著升高，提示抑制RIPK1表达可有效缓解H/R诱导的心肌细胞氧化损伤，并抑制心肌细胞凋亡。本研究通过双荧光素酶报告基因实验证实RIPK1是miR-124-3p的靶基因，进一步研究显示RIPK1过表达可明显逆转miR-124-3p过表达对心肌细胞的保护作用。说明miR-124-3p过表达可通过下调RIPK1表达进而对心肌细胞H/R损伤产生保护作用。提示miR-124-3p可能为心肌缺血再灌注损伤治疗的新靶点。

综上所述，miR-124-3p可通过抑制下游靶基因RIPK1表达而增强细胞氧自由基清除能力进而减轻心肌细胞H/R损伤，并可发挥抗凋亡作用进而保护心肌细胞，为临床治疗提供潜在靶点。但本研究实验结果仍需进行体内研究进而为miR-124-3p在心血管疾病治疗过程中的应用奠定理论基础。