外周血Th22细胞在病毒性心肌炎患者中的水平变化及临床意义

谢红英，罗晓丽，罗浩

病毒性心肌炎是一种临床常见的心脏疾病，其发病原因与前期病毒感染密切相关。关于病毒性心肌炎的发病机制，假说众多，而病毒感染后引起的炎症反应在其中具有重要作用[1]。机体因外源性病原体入侵，引起心肌局限性或弥漫性炎症病变，导致炎性细胞向该部位聚集，同时过度激活自身免疫反应，损伤心肌细胞[2]。有研究显示，病毒性心肌炎患者外周血炎性因子水平明显升高，主要表现为肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素-1β等[3]。近年来，有研究表明，病毒性心肌炎是一类炎症性疾病，与自身免疫功能紊乱密切相关，不同类型的CD4+T细胞亚群在病毒性心肌炎的发生、发展过程扮演了重要作用[4]。Th22细胞是一类新的CD4+T细胞亚群，其特异性分泌IL-22，激活相应信号通路如JAK-STAT信号通路，参与了多种疾病如自身免疫性疾病及恶性肿瘤的发病过程[5]。Th22细胞是否参与了病毒性心肌炎的发生、发展，目前相关研究尚未阐明。因此，本研究拟通过分析病毒性心肌炎患者外周IL-22水平，旨在探讨Th22细胞在病毒性心肌炎发病中的作用，为该疾病的临周血Th22细胞床诊治提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取2013年5月～2018年5月于陆军军医大学（第三军医大学）大坪医院心血管内科就诊的病毒性心肌炎患者180例作为研究对象，其中男性105例，女性75例，年龄18岁～70岁，平均年龄（35.4±15.8）岁，所有患者均符合病毒性心肌炎诊断与治疗指南[6]。排除标准：患有冠心病、感染性心内膜炎及心脏瓣膜病的患者；存在自身免疫性疾病和免疫缺陷的患者；恶性肿瘤的患者。根据入选患者心功能指标，评判病情严重程度，射血分数（LVEF）≥50%为轻度（70例），LVEF在40%～49%为中度（56例），LVEF＜40%为重度（54例）。同时选取60例健康体检人群为对照组。健康对照组和病毒性心肌炎组及病毒性心肌炎各严重程度组间在性别、年龄等方面无统计学差异（P＞0.05）。该研究获得了我院伦理委员会的批准并征得了患者书面知情同意。

1.2 主要试剂RPMI 1640细胞培养液（美国Gibco公司）、胎牛血清（美国HyClone公司）；佛波酯及离子霉素（美国Sigma公司）；莫能霉素（中国瑞利康公司）；淋巴细胞分离液、细胞固定液及细胞破膜剂（美国GE公司）；单克隆抗体（CD4和IL-22）（美国Invitrogen公司）；IL-22 和IL-17酶联免疫试剂盒（中国博士德公司）。

1.3 方法

1.3.1 外周血Th22细胞水平检测首先制备样本，抽取病毒性心肌炎组患者及健康对照组空腹静脉血5 ml，经肝素充分抗凝后，提取单核细胞。在无菌操作台中，将上述单核细胞接种于培养板，培养板中含RPMI-1640培养基，同时加入抗菌素（佛波酯，剂量30 μl，浓度1 μg/ml），培养箱中孵育5 h。收集上述细胞，加入抗人CD4单克隆抗体10 μl，震荡混匀，室温避光孵育30 min后，加入2 ml破膜液，静置离心后（1000 g，5 min，室温），吸去上清，加入IL-22单克隆抗体10 μl，震荡混匀后，待上机检测。

1.3.2 外周血炎性细胞因子（IL-22、IL-17）的检测 取病毒性心肌炎组患者及健康对照组清晨空腹静脉血5 ml，离心后收集上清，采用ELISA法测定不同病毒性心肌炎组间外周血IL-22、IL-17水平及健康对照组IL-22水平。

1.4 统计学分析采用专业统计学软件（SPSS 19.0）进行数据分析与处理。计量资料以均值±标准差（±s）表示，两组间（健康对照组与病毒性心肌炎组）比较采用t检验，而不同严重程度的病毒性心肌炎组间比较采用单因素方差分析。采用Spearman相关法分析外周血Th22细胞与IL-22、IL-17的相关性。运用Graphpad软件做ROC曲线分析，计算外周血Th22细胞的ROC曲线下面积（AUC）、最佳工作点（OOP）、敏感性及特异性，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病毒性心肌炎组与健康对照组外周血Th22细胞及细胞因子IL-22水平与健康对照组比较，病毒性心肌炎组患者外周血Th22细胞及细胞因子IL-22水平升高（P＜0.05）（表1、图1）。

表1 病毒性心肌炎组与健康对照组外周血Th22细胞及IL-22水平比较

图1 两组外周血Th22细胞水平比较

2.2 不同严重程度病毒性心肌炎组间Th22细胞及相关细胞因子水平的比较不同严重程度病毒性心肌炎组间外周血Th22细胞、IL-22及IL-17水平比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。其中，重度病毒性心肌炎组上述指标水平最高，中度组次之，轻度组最低（表2）。

2.3 病毒性心肌炎组外周血Th22细胞与相关细胞因子的相关性分析病毒性心肌炎组患者外周血Th22细胞水平与IL-22、IL17呈显著正相关（r=0.874，P＜0.0001；r=0.865，P=0.0001）（图2）。

2.4 外周血Th22细胞水平对病毒性心肌炎患者病情严重程度预测的ROC曲线分析通过以外周血Th22细胞水平来评估病毒性心肌炎患者病情严重程度，绘制ROC曲线。其结果显示，外周血Th22细胞水平的曲线下面积（AUC）为0.846（95%CI 0.754～0.937），其最佳工作点分别为8.1 %，提示外周血Th22细胞水平＞8.1 %，此时预测病毒性心肌炎患者严重程度的精确率较高（敏感性为76.9%和特异性为81.0%）（图3）。

3 讨论

病毒性心肌炎是临床常见的心血管疾病之一，多数患者预后良好，少数迁延不愈，持续炎症，可使心脏扩大，进展为扩张性心肌病。目前，多种方法用于病毒性心肌炎的诊断与病情严重程度的评估，如心肌活检作为诊断病毒性心肌炎的金标准，但其具有一定创伤，临床运用受到局限[7]。心脏超声可作为病毒性心肌炎的辅助诊断，对于评价心功能具有一定临床价值，但特异性较差[8]。传统的炎性指标如C反应蛋白、中性粒细胞比例等，对于病毒性心肌炎病情严重程度的评估，有一定的参考价值，但特异性偏低[9]。因此，探寻特异性指标，准确预测病毒性心肌炎患者病情严重程度，对于提高病毒性心肌炎患者临床疗效及预后，具有重要的临床意义。

表2 不同严重程度病毒性心肌炎组间Th22细胞及相关细胞因子水平的比较

图2 病毒性心肌炎组患者外周血Th22细胞水平与IL-22、IL17的相关性

图3 病毒性心肌炎组患者外周血Th22细胞对其病情严重程度的预测价值分析

有研究显示，病毒性心肌炎是一类自身免疫功能异常引起的炎症性疾病[10]。一方面，病毒可损伤心肌细胞导致细胞凋亡或坏死，同时心肌细胞释放自身抗原[11]。机体通过固有免疫，激活Toll样受体2，进而促进外周血单核细胞分泌相关细胞因子（IL-12、IL-1β、TNF-α），聚集于受损的心肌局部，在局部形成炎症反应，发挥免疫应答作用[12]。除了固有免疫以外，有研究显示，Th17细胞及其特异性分泌的IL-17在病毒性心肌炎的免疫损伤和炎症反应中发挥重要作用，其中，病毒性心肌炎患者体内Th17和IL-17水平明显升高[13]。Th22细胞是一类与Th17细胞作用类似的CD4+淋巴细胞亚群，主要分泌IL-22，发挥促进炎症的作用。外周血Th22细胞除了特异性分泌IL-22以外，还可分泌IL-17及TNF-α等，在炎症性疾病、自身免疫性疾病及恶性肿瘤患者中明显升高，且与病情的严重程度及预后相关[14-16]。外周血Th22细胞是否参与了病毒性心肌炎的发病，同时与病情严重程度如何，目前尚不清楚。本研究对病毒性心肌炎患者外周血Th22及IL-22水平进行研究，结果显示，与健康对照组比较，病毒性心肌炎患者外周血Th22细胞及IL-22水平明显升高，表明病毒性心肌炎的发生可能与Th22细胞活化有关。有研究显示，病毒性心肌炎患者存在调节性T细胞功能与分化失调，是造成免疫功能异常活化，引起病情加重的重要原因[17]。本研究进一步发现，病毒性心肌炎患者外周血Th22细胞及相关细胞因子IL-22及IL-17与病情严重程度呈正相关，通过ROC曲线分析发现，其曲线下面积较大，预测价值较高，表明其对病情严重程度有一定预测价值。Th22细胞是炎症反应放大的重要环节，有研究显示，抑制Th22细胞分化，可显著降低体内炎性细胞因子水平，从而降低炎症反应。针对病毒性心肌炎患者，检测外周血Th22细胞及相关细胞因子水平，不仅可预测患者病情严重程度，同时还可为其治疗提供新的靶点。

综上所述，病毒性心肌炎患者外周血Th22细胞水平与病情严重程度密切相关，对病毒性心肌炎病情评估及预后判断具有重要的临床意义。